论文摘要
棉花是我国重要的经济作物,是一种较耐盐碱大田作物,同时也是改良利用盐碱地的先锋作物之一。已有很多耐盐相关基因转化到了棉花当中,且不同程度的提高了转基因棉花的耐盐性。但目前耐盐基因工程的研究主要集中于单基因转化工作,对基因聚合提高棉花耐盐性的报道较少。由于作物的耐盐性是受多基因控制的复杂遗传性状,可能依赖于多个基因之间的协调作用。因此,将多个耐盐相关基因聚合到同一作物中有可能会进一步提高转基因植物对盐胁迫的耐受性。转基因聚合棉花BT （betA×TsVP）的耐盐性分析betA基因来源于大肠杆菌,编码的胆碱脱氢酶可以催化胆碱到甜菜碱的合成,转入该基因可提高转基因植物胞内甘氨酸甜菜碱含量；来自于盐芥的TsVP基因编码V-H+-PPase,该基因过表达可提高跨液泡膜逆浓度质子梯度,从而提高离子转运效率。已有研究表明,过量表达这两个单基因都可以明显改善植物的耐盐性。本工作以转betA基因（BL）和转TsVP基因棉花（TL）纯合株系为亲本,通过有性杂交方法获得了聚合有两个基因的棉花植株,即betA×TsVP（BT）。PCR检测和RT-PCR的测定结果表明,betA和TsVP两个基因稳定整合于基因聚合棉花植株中,并进行了活跃表达。甘氨酸甜菜碱含量及V-H+-PPase水解活性结果表明这两个基因很好的在聚合植株中行使各自的功能。盐胁迫下对转单基因植株和基因聚合植株进行了生理生化分析测定,结果表明转基因聚合植株在一些生理指标的测定结果上要好于转单基因植株,表现出更高的耐盐性。盐胁迫可以致使棉花叶片失水,使得植株出现萎蔫症状,棉花经盐胁迫处理14天后,各转基因株系棉花的长势优于对照植株且失水程度较轻。在胁迫处理第14天时,野生型对照植株的叶片相对含水量降低为71.12%,各转基因植株的叶片相对含水量降低为76.20-78.25%,其中转基因聚合株系BT1的叶片相对含水量（78.25%）最高。随着盐胁迫天数的增加,各株系叶片的渗透势表现出下降趋势。其中各转基因株系保持了低于野生型对照的渗透势,且转betA株系和转基因聚合株系BT1叶片细胞的渗透势达到显著差异水平。胁迫处理至第14天时,各转基因株系植株叶片的叶绿素含量在1.66～1.75 mgg-1FW之间,显著高于野生型植株叶片的1.29 mg g-1FW的叶绿素含量。此外,转基因聚合株系BT1的叶绿素含量显著高于转betA株系。随着胁迫天数的增加,各株系叶片的Pn和Gs值均呈现下降的趋势。盐胁迫处理第14天,转基因聚合株系的Pn值要高于转betA单基因植株。对于Gs而言,转基因聚合株系在胁迫处理后均高于野生型对照和转单基因株系。说明各株系植株叶片的净光合速率及气孔导度在高盐胁迫条件下均受到抑制,与野生型对照相比,各转基因植株的受抑制程度较轻,其中基因聚合株系BT1的受抑制程度还轻于转单基因株系。说明基因聚合进一步保护了盐胁迫条件下的植物光合系统,减缓光抑制损伤作用。盐胁迫处理后,各株系棉花叶片光系统II的Fv/Fm值呈现逐步下降的趋势,表明各株系的PSII反应中心都受到损伤。其中各转基因株系棉花的Fv/Fm值均高于对照植株,且转基因聚合株系BT1还显著高于转单基因株系。盐胁迫导致膜系统受到伤害,不同株系植株的叶片MDA含量和离子渗漏率表现出大幅度升高趋势。在盐胁迫处理7、14、21天时,各转基因株系的离子渗漏均低于野生型对照；并且在处理14天时达到显著差异水平,其中基因聚合株系的离子渗漏还显著低于BL株系。结果表明在相同的高盐胁迫条件下,基因聚合棉花株系的细胞膜受损程度低,细胞受伤害程度最小,保持了较好的膜稳定性。植物正常代谢过程和在各种环境胁迫下都产生大量的活性氧和自由基,自由基的积累可破坏细胞结构和功能。植物体内具有一系列抗氧化保护机制,以清除胞内的活性氧以免达到毒害水平。胁迫处理后野生型对照和各转基因植株的SOD活性上升,但在盐胁迫第7天后有所下降。在盐胁迫处理过程中,各转基因株系植株叶片的SOD活性显著高于野生型对照,其中基因聚合植株BT1的SOD活性在第7天时（2905.75 unit g-1 FW）显著高于转单基因植株BL（2610.05unitg-1 FW）和TL（2675.36 unit g-1 FW）。在盐胁迫处理14天时,除BL转基因株系外,各转基因株系显著高于野生型对照,但是彼此之间无显著差异。说明转基因株系细胞维持了更好的SOD活性,具有更强的氧自由基清除能力,从而更好的缓解细胞在胁迫环境下受到的氧化胁迫损伤。对于抗氧化酶POD和CAT来说,也有着同样的变化趋势。在盐处理过程中,转基因株系中的POD和CAT酶活始终高于野生型对照；胁迫处理第七天时,转基因聚合株系BT中两者的活性显著高于转单基因株系。盐胁迫通过渗透胁迫、离子伤害等过程损伤植物,最普遍和最显著的效应就是抑制生长。在盐胁迫处理21天后,生物量结果表明盐胁迫抑制了棉花的正常生长。在胁迫处理条件下,转基因植株的生物量均高于野生型植株。高盐胁迫21天后,基因聚合植株BT1的总干重上还均高于转单基因植株BL和TL,并达到显著差异水平。以上的生理指标的测定结果表明,盐胁迫条件下,与转单基因棉花植株相比,基因聚合植株维持了较低的渗透势和更强的叶片保水能力,并且具有较高的抗氧化酶活性,从而加强了超氧自由基的清除能力,减缓对光和系统和细胞膜的损伤。因此基因聚合可以在一定程度上进一步提高棉花在苗期的耐盐性。通过转基因聚合植株和转单基因植株的比较,发现与亲本植株相比转基因聚合植株的耐盐性有一定提高,但并不是简单的累加效应。因此,采用转基因聚合策略培养抗逆性大幅度提高的植物品种需要精细的实验设计,需要进一步了解逆境对植物伤害的机理,通过针对性强的植物基因工程手段可能会大幅度提高作物的抗逆性。共转化法转基因聚合棉花的获得利用农杆菌介导的茎尖一次转化法得到了转基因聚合棉花,载体T-DNA区同时含有来自大肠杆菌的甜菜碱合成酶基因betA、玉米的磷脂酰肌醇合成酶ZmPIS基因和盐芥液泡膜H+-PPase基因TsVP。筛选标记基因为EPSP基因（编码5-烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶,抗草甘磷）。经过除草剂筛选后,对存活植株进行了PCR验证,得到阳性植株。在基因聚合株系中能检测到三个目的基因的目的条带。对PCR阳性的植株进行Southern杂交分析,由于时间关系仅在一个株系中检测到PIS基因的杂交信号。有关转基因株系的Southern杂交工作有待进一步深入,并验证基因聚合株系的抗逆生理表现。