糖尿病大鼠缺血再灌注后TGF-β1及MMP-9的表达

论文摘要

背景和目的糖尿病是缺血性脑血管病的主要危险因素，临床研究发现糖尿病患者脑血管的发病率、致残率及死亡率均比未患糖尿病者高。随着人们饮食结构的变化及社会、工作压力的增加，糖尿病的发病呈上升趋势，因此对糖尿病患者脑卒中的研究是目前的热点之一。但迄今为止有关糖尿病加重脑缺血的损伤机制尚未得到统一认识，而且在研究过程中使用的模型也不尽相同。近年来细胞因子在脑缺血中的作用已成为研究的热点之一。转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）是一种具有多种生物学功能的细胞因子，对许多器官和组织的生长．分化起着重要作用，是迄今为止了解功能最复杂的细胞因子之一。转化生长因子β1是一种分子量为25KD的多功能活性肽，可由体内或体外各种正常或已转化的细胞产生，在中枢神经系统可由小胶质细胞、星形胶质细胞或神经元产生。基质金属蛋白酶-9（matrixmetalloproteinase，MMP-9）是一组含Zn2+的能降解细胞外间质的蛋白酶，其主要底物包括明胶、胶原Ⅳ、Ⅴ、弹性蛋白。有人已证明在实验性大脑中动脉阻断/再灌注（MCAO/R）中血管壁各成分的含量大约呈平行下降，人类内皮细胞与细胞外基质的连接被阻断时、正常细胞外基质连接的降解会导致细胞死亡、水肿、丧失生存力。由此我们设想高血糖可以加重脑缺血损伤是否与其影响TGF-β1、MMP-9在脑组织的表达有关。本试验通过采用链脲佐菌素腹腔注射来破坏大鼠的胰岛细胞，从而使大鼠体内的胰岛素减少而诱发糖尿病模型。这种方法复制的糖尿病模型与临床发病过程相似且已被证明是成功的。采用线栓法制作大脑中动脉栓塞模型。通过神经功能学评分和TTC染色观察大鼠的脑组织梗死的体积；同时采用免疫组化法观察不同时间点脑组织中转化生长因子-β1（TGF-β1）和基质金属蛋白酶-9（MMP-9）的表达，探讨糖尿病加重脑损伤的可能机制，为改善糖尿病病人合并脑卒中的治疗及预后提供一定的理论依据。材料方法（1）健康雄性SD大鼠36只，体重180～220g用链脲佐菌素（streptozotocinSTZ，Sigma公司）制作糖尿病模型，3天后大鼠随机血糖≥16.7mmol/l为糖尿病模型制作成功，饲养6-7周。大鼠随机分为糖尿病组（n=18）和非糖尿病组（n=18），然后再分别分为缺血2h再灌注12h、24h组、假手术组（n=6）。然后参照曹勇军，程彦斌报道的大鼠缺血再灌注模型的制作方法，制作缺血再灌注模型。假手术组除不将尼龙线插入颈内动脉外，余同手术组；（2）各组大鼠在缺血再灌注模型制作成功后进行神经功能学评分，然后在不同的时间点处死大鼠取出脑组织，采用TTC染色观察大鼠脑组织的梗死体积，免疫组化SP法观察大鼠脑组织梗死区及其半暗带区基质金属蛋白酶—9及转化生长因子—β1的阳性表达；（3）应用SPSS10.0统计软件进行数据处理，先进行正态分布和方差齐性检验，符合正态分布和方差齐后，两组均数间比较采用t检验，多组均数间比较采用单因素方差分析。以α=0.05作为检验水准，实验数据用均数±标准差（（?）±s）表示。结果（1）糖尿病模型制作成功后，与正常大鼠相比糖尿病大鼠明显出现多饮、多食、多尿等糖尿病的典型症状；血糖值≥16.7mmol/1；（2）缺血再灌注模型制作成功后，对其进行神经功能学评分，发现糖尿病大鼠的神经功能学评分（2.13±0.71）分较非糖尿病大鼠（1.28±0.46）评分高，差异有非常显著性意义（t=5.91，P值均<0.01）；（3）各组病理切片苏木素伊红（HE）染色观察：光镜下糖尿病组与非糖尿病组比缺血性改变明显加重，表现为组织疏松、神经元核质固缩、移位，胞浆疏松，染色变浅，胞浆及血管周围空化，坏死灶周围炎性细胞浸润明显较正常组重。细胞形态改变比正常组明显。而假手术组在光镜下组织结构清楚，核仁存在，病理改变不明显；（4）脑梗死体积的比较：糖尿病大鼠在缺血2h再灌注12h、24h的脑梗死体积分别为（146.0±13.00）mm3(占相应截面总体积的比例为（30.4±6.3％）、（241.50±38.11）mm3(占相应截面总体积的比例为（36.4±7.5％）；非糖尿病大鼠12h、24h脑梗死体积分别为（87.67±18.30）(占相应截面总体积的比例为（21.34±3.9％）（144．50±15．42）mm3（占相应截面总体积的比例为26.3±5.5％），两组比较均有显著统计差别（P值均<0.01）。假手术未见明显的梗死灶；（5）各组大鼠缺血半暗带区脑组织中TGF—β1的表达：可见TGF—β1免疫阳性细胞主要在神经元和胶质细胞内表达，胞浆呈棕黄色。糖尿病和非糖尿病大鼠非缺血组（假手术组）TGF—β1在脑组织表达量较低，而在缺血2小时再灌注12h、24h时TGF—β1表达量呈进行性增高（P值均<0.01）；而其在非糖尿病组缺血再灌注组TGF-β1表达量又明显高于糖尿病缺血再灌注组（P值均<0.01）；TGF—β1在缺血再灌注组的表达明显比假手术组高（P值均<0.01）；（6）各组大鼠缺血半暗带区脑组织中MMP-9的表达：可见MMP-9免疫阳性细胞，呈棕黄色淡染，主要表达在缺血神经元、胶质细胞、血管内皮细胞等细胞的胞浆；在缺血2h再灌注12h、24h内MMP-9的表达呈进行增强，而糖尿病大鼠脑组织的阳细胞数明显多于非糖尿病组大鼠（P值均<0.01），假手术组及缺血组非缺血侧半球脑组织未见MMP-9的表达。结论（1）“链脲佐菌素腹腔注射法制作糖尿病模型”法，具有可重复性、稳定性较好，对动物创伤较小，易于恢复，存活率高的优点；（2）糖尿病可以加重大鼠脑缺血的损伤，促进脑组织内MMP-9的表达，同时抑制TGF—β1的表达，提示其机制可能是通过增加细胞外基质的溶解，促进炎性反应及从而加速细胞的调亡实现的；（3）在糖尿病患者发生脑缺血通过采用某种方法抑制MMP-9的表达促进TGF-β1的表达可能成为一种改善其预后的重要手段之一。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 正文部分
• 1和MMP-9的表达'>糖尿病大鼠缺血再灌注后TGF-β₁和MMP-9的表达
• 引言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 附图
• 参考文献
• 综述部分
• 糖尿病与对脑缺血
• 参考文献
• 缩略语表
• 致谢