山羊乳腺上皮细胞系的建立与培养

论文摘要

本实验采用组织块和酶消化法分离山羊乳腺上皮细胞,对纯化的细胞进行单细胞克隆并鉴定,采用二次回归正交旋转组合试验设计,MTT显色法定量探索山羊乳腺上皮细胞培养的最适条件,酶联免疫吸附实验与聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定乳腺上皮细胞是否具有正常的生理功能,最终成功建立了山羊乳腺上皮细胞系。试验一使用组织块和酶消化法分离山羊乳腺细胞,结果表明组织块培养可以分离纯化出增殖能力较强的上皮细胞,Ⅰ型胶原酶和透明质酸酶联合使用可获得较纯的上皮细胞,贴壁后增殖能力较强,但多次传代后细胞增殖能力有所下降。刮除法、相差消化法以及相差贴壁法三种方法联合使用,经过2-3次传代可以得到细胞形态均一的乳腺上皮细胞。试验二本实验进行乳腺上皮细胞单细胞克隆,发现口吸管法、克隆环法和细胞稀释法细胞克隆率分别为0、5.9%和3.5%,一共得到3株细胞克隆,形态学观察与细胞角蛋白18鉴定为乳腺腺泡上皮细胞。克隆环法细胞克隆率最高,但是操作很难熟练进行,易导致克隆细胞的不纯。细胞稀释法操作简单易行,对细胞伤害小,克隆率较高。试验三采用五因素五水平的二次回归正交旋转组合试验设计,MTT显色法定量研究不同浓度的胎牛血清（FBS）、氢化可的松、胰岛素、转铁蛋白、表皮生长因子（EGF）对山羊乳腺上皮细胞生长的影响,研究发现山羊乳腺上皮细胞培养的最适条件为12%胎牛血清、4μg/ml氢化可的松、10μg/ml胰岛素、8μg/ml转铁蛋白及6ng/ml表皮生长因子的DMEM/F12。试验四使用催乳素诱导种在铺有胶原的培养板中的山羊乳腺上皮细胞,采用ELISA法检测细胞上清液中β-酪蛋白的表达检测,培养48hβ-酪蛋白含量为0.5mg/ml,72h为0.75mg/ml。聚丙烯酰胺凝胶电泳进一步证明β-酪蛋白的分泌。说明本实验所获得的山羊乳腺上皮细胞具有正常的生理功能。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 文献综述
• 1 乳房的结构与乳腺的生物学研究
• 1.1 乳房的结构
• 1.2 乳腺的生物学研究
• 2 乳腺细胞培养方法的研究进展
• 3 乳腺上皮细胞的类型及相互关系
• 4 现有的动物乳腺细胞系
• 5 激素和细胞外基质对乳腺上皮细胞生长的调控
• 5.1 细胞外基质的作用
• 5.2 激素等调节因子的作用
• 6 本论文研究的意义及主要内容
• 试验部分
• 试验一 山羊乳腺上皮细胞的分离与纯化
• 1 材料与方法
• 1.1 主要试剂
• 1.2 有关试剂的配置
• 1.3 培养仪器和用具
• 1.4 乳腺组织来源
• 1.5 山羊乳腺上皮细胞的获取方法
• 1.5.1 组织块培养法
• 1.5.2 酶消化法
• 1.6 细胞活力的评定
• 1.7 山羊乳腺上皮细胞的纯化
• 1.7.1 刮除法
• 1.7.2 相差消化法
• 1.7.3 相差贴壁法
• 1.8 细胞生长曲线的测定
• 2 结果与分析
• 2.1 不同分离方法获得山羊乳腺上皮细胞的比较
• 2.1.1 组织块培养法
• 2.1.2 酶消化法
• 2.2 山羊乳腺上皮细胞的纯化
• 2.3 细胞生长曲线
• 2.4 山羊乳腺上皮细胞的形态观察
• 3 讨论
• 3.1 组织来源
• 3.2 分离方法
• 3.3 纯化方法
• 3.4 细胞生长曲线
• 4 小结
• 试验二 山羊乳腺上皮细胞单细胞克隆的制备与鉴定
• 1 材料与方法
• 1.1 主要试剂
• 1.2 培养用液
• 1.3 培养仪器和用具
• 1.4 实验方法
• 1.4.1 山羊乳腺上皮细胞单克隆的制备
• 1.4.1.1 口吸管法
• 1.4.1.2 克隆环法
• 1.4.1.3 细胞稀释法
• 1.4.2 羊乳腺上皮细胞的鉴定
• 1.4.2.1 形态学鉴定
• 1.4.2.2 山羊乳腺上皮细胞角蛋白18的鉴定
• 2 结果与分析
• 2.1 山羊乳腺上皮细胞单克隆的制备
• 2.2 山羊乳腺上皮细胞的鉴定结果
• 2.2.1 形态学鉴定
• 2.2.2 山羊乳腺上皮细胞角蛋白18的鉴定
• 3 讨论
• 4 小结
• 试验三 不同生物活性因子对传代细胞生长的影响
• 1 材料与方法
• 1.1 试剂与材料
• 1.1.1 试剂
• 1.1.2 测定用液
• 1.1.3 培养仪器和用具
• 1.2 实验方案
• 1.3 MTT 法测定山羊乳腺上皮细胞生长活性
• 1.4 数据分析及处理
• 2 结果与分析
• 2.1 五因素二次回归正交旋转组合试验结果
• 2.2 回归方程的建立及检验
• 2.2.1 数学模型的建立
• 2.2.2 二次回归模型的显著性检验及重建二次回归模型
• 2.2.3 回归方程的优化分析
• 2.2.3.1 主效应分析
• 2.2.3.2 单效应分析
• 2.2.3.3 双因素交互效应分析
• 2.2.3.4 细胞生长最优培养条件的确定
• 3 讨论
• 4 小结
• 试验四 酪蛋白产品的诱导
• 1 材料与方法
• 1.1 试剂与材料
• 1.1.1 试剂
• 1.1.2 有关试剂的配置
• 1.1.3 培养仪器和用具
• 1.2 从羊奶中分离酪蛋白
• 1.3 山羊乳腺上皮细胞乳蛋白的诱导
• 1.4 间接ELISA 法检测细胞上清中β-酪蛋白的表达
• 1.5 不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳测定乳蛋白
• 1.5.1 原理
• 1.5.2 试剂制备
• 1.5.3 电泳
• 2 结果与分析
• 2.1 酪蛋白的分离
• 2.2 间接ELISA法检测细胞上清中β-酪蛋白的表达检测
• 2.3 不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳结果
• 3 讨论
• 3.1 酪蛋白的分离
• 3.2 间接ELISA法检测细胞上清中β-酪蛋白的表达检测
• 3.3 不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳测定乳蛋白
• 4 小结
• 总结
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表的学术论文目录