胆甾醇基—壳聚糖衍生物自聚集纳米粒的制备及其用作药物载体的初步研究

论文摘要

疏水改性多糖是指在多糖的亲水骨架中引入疏水基团，使其成为两亲性高分子聚合物，具有表面活性剂的性质。这种新型的高分子表面活性剂能在水相介质中通过分子内及分子间的疏水作用力聚集形成纳米微粒，可作为疏水小分子药物及生物活性大分子（多肽、蛋白和基因）的载体，在医药和生物技术领域有着潜在的应用价值。壳聚糖作为自然界唯一存在的碱性多糖（聚电解质），具有良好的生物及物理化学特性，是一种优良的生物材料，但由于这种多糖材料本身的复杂性（来源、质量标准、检测方法等），对其疏水改性衍生物在自组装领域的研究还处于起步阶段，仍有很多问题需要解决。本课题结合内源性小分子—胆甾醇的特殊甾环结构（疏水性）和壳聚糖的氨基多糖优势，合成新型两亲性高分子聚合物，用以制备自聚集凝胶纳米粒，并系统研究其分子结构和凝胶纳米微粒的形态结构之间的关系，初步推导其自组装机制；筛选出形态规则、稳定性好的凝胶纳米体系，考察其对疏水小分子模型药物及蛋白模型药物的包埋和释放行为，综合评价这种新型自聚集纳米微粒用作药物载体的可行性。课题的主要研究内容如下：采用化学的方法合成了不同分子结构、不同取代度的系列胆甾醇基壳聚糖衍生物—胆甾醇基壳聚糖（CHCS）和胆甾醇基-羧甲基壳聚糖（CCMC），并应用先进的分析手段（电位滴定、红外光谱法（IR）、核磁共振波谱法（NMR）等）对原料、中间产物以及产物进行了结构表征，衍生物分子中的胆甾醇基取代度（3.2％～12.5％）采用元素分析的方法进行检测。CCMC和CHCS具有两亲性，荧光探针法检测结果显示它们在水相介质中能自聚集形成疏水结构域，其临界聚集浓度(3.00×10-2～6.48×10-3mg／mL)随着胆甾醇基取代度的增加而降低；CCMC为两性聚电解质，其自聚集性质和水相介质的pH相关，在等电点附近更容易发生聚集。采用探头超声法在水中制备了CCMC和CHCS自聚集凝胶纳米粒，并通过扫描电镜（SEM）、透射电镜（TEM）、动态激光散射法（DLLS）及Zeta-电位对其大小、形态以及表面性质进行了检测。当胆甾醇基取代度＞3.2％时，CCMC在水相中的自聚集凝胶纳米粒有着规则的球状形态，粒径（180～＜50nm）随着胆甾醇基取代度的增加而减小；CCMC自聚集凝胶纳米粒的Zeta-电位为负值，说明带负电荷的羧甲基位于纳米粒的表面，同时Zeta-电位的绝对值随着胆甾醇基取代度的增加而降低，从而造成纳米粒凝聚现象的发生。在胆甾醇基取代度相同的条件下，CHCS自聚集凝胶纳米粒类似球状，表面粗糙，结构疏松；而CCMC自聚集凝胶纳米粒球状形态更为规则，表面更为光滑，结构更为致密。这主要是因为羧甲基的引入阻碍了壳聚糖分子内及分子间氢键的形成，使壳聚糖分子主链在水溶液中由刚性向柔性发生转变，进而更容易发生卷曲的结果。采用共混-凝胶色谱分离法制备了负载考马斯亮蓝G-250的CCMC-2自聚集凝胶纳米粒，可见分光光度法检测其载药量和包封率分别高达18.8％和67.1％；考马斯亮蓝G-250在CCMC-2自聚集凝胶纳米粒中的释放极为缓慢，在72h内药物释放量仅为3.73％。采用NH4+梯度法制备了负载表阿霉素的CHCS自聚集凝胶纳米粒，荧光分光光度法检测其载药量和包封率分别高达12.5％和55.4％。透射电镜观察发现载药CHCS自聚集凝胶纳米粒有着比空白纳米粒更为规则的球状形态，更高的稳定性，我们认为这是因为表阿霉素具有两亲性，在药物包埋过程中起到表面活性的作用。表阿霉素在CHCS自聚集凝胶纳米粒中的释放速度随着释放介质pH值的升高而减慢，在醋酸盐缓冲液（pH=3.5）中释放较快，8h内其释放量即高达70％，而在去离子水（pH=5.8）及磷酸盐缓冲液（PBS，pH=7.4）中释放较为缓慢，72h内的释放量分别为34.7％和24.9％，说明CHCS自聚集凝胶纳米体系有希望成为表阿霉素类抗肿瘤药物的控缓释载体。CCMC-2自聚集凝胶纳米粒和牛血清白蛋白（BSA）充分混合后能形成稳定的复合物，其过程包括凝胶纳米粒的解体、疏松及致密结构复合物的形成，荧光法检测它们之间的虚拟缔合常数高达6.0×104；圆二色谱法检测BSA的α-螺旋含量随着复合物的形成而降低，同时其对抗变性剂（尿素）的能力显著增强。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 第一章 绪论
• 1.1 聚合物纳米微粒在药物载体领域的研究进展
• 1.1.1 单体聚合法制备凝胶纳米微粒
• 1.1.2 后分散法制备凝胶纳米微粒
• 1.1.3 两亲性聚合物自组装形成纳米微粒
• 1.2 疏水改性多糖自聚集凝胶纳米粒的研究进展
• 1.2.1 疏水改性水溶性多糖的自聚集凝胶纳米粒
• 1.2.2 壳聚糖及其疏水改性衍生物在自组装领域的研究进展
• 1.3 课题的提出
• 参考文献
• 第二章 胆甾醇基-壳聚糖衍生物的合成及结构表征
• 2.1 前言
• 2.2 实验部分
• 2.2.1 仪器与试剂
• 2.2.2 O-羧甲基壳聚糖的制备
• 2.2.3 胆甾醇琥珀酸酯的合成仪器与试剂
• 2.2.4 胆甾醇琥珀酰基,N-羟基琥珀酸酯的合成
• 2.2.5 N-胆甾醇琥珀酰基,羧甲基壳聚糖的制备
• 2.2.6 N-胆甾醇琥珀酰基壳聚糖的制备
• 2.3 实验结果与讨论
• 2.3.1 羧甲基壳聚糖的制备
• 2.3.2 两亲性壳聚糖衍生物的制备
• 2.4 小结
• 参考文献
• 第三章 胆甾醇基-壳聚糖衍生物溶液性质的考察及其自聚集凝胶纳米粒的制备
• 3.1 前言
• 3.2 实验部分
• 3.2.1 仪器与试剂
• 3.2.2 两亲性考察及临界聚集浓度的测定
• 3.2.3 等电点的检测
• 3.2.4 自聚集凝胶纳米粒的制备
• 3.2.5 粒径、粒径分布及Zeta-电位的检测
• 3.2.6 自聚集凝胶纳米粒形态的观察
• 3.3 实验结果与讨论
• 3.3.1 两亲性考察及临界胶束浓度的检测
• 3.3.2 自聚集凝胶纳米粒的制备及其形态观察
• 3.3.3 自聚集凝胶纳米粒形成机制的探讨
• 3.4 小结
• 参考文献
• 第四章 胆甾醇基-壳聚糖衍生物自聚集凝胶纳米粒作为小分子药物载体的研究
• 4.1 前言
• 4.2 实验部分
• 4.2.1 仪器与试剂
• 4.2.2 载药自聚集凝胶纳米粒的制备
• 4.2.3 体外释放实验
• 4.3 实验结果与讨论
• 4.3.1 考马斯亮蓝G-250在CCMC-2自聚集凝胶纳米粒中的包埋及释放特征
• 4.3.2 表阿霉素在CHCS自聚集凝胶纳米粒中的包埋及释放特征
• 4.4 小结
• 参考文献
• 第五章 胆甾醇基-羧甲基壳聚糖自聚集凝胶纳米粒与牛血清白蛋白相互作用的研究
• 5.1 前言
• 5.2 实验部分
• 5.2.1 仪器与试剂
• 5.2.2 CCMC-2自聚集凝胶纳米粒的制备
• 5.2.3 CCMC-2-BSA复合物的制备
• 5.2.4 荧光法检测CCMC-2和BSA之间的缔合常数
• 5.2.5 圆二色法检测CCMC-2-BSA复合物的性质
• 5.3 实验结果与讨论
• 5.3.1 CCMC-2-BSA复合物的形成
• 5.3.2 CCMC-2和BSA之间缔合常数的测定
• 5.3.2 圆二色法检测CCMC-2-BSA复合物的性质
• 5.4 小结
• 参考文献
• 全文总结
• 致谢
• 在学期间发表的学术论文与研究成果