论文摘要
10-23脱氧核酶是利用体外筛选技术得到的一个具有切割RNA活性的单链DNA分子。它具有高效的催化活性和特异的序列识别能力,切割位点位于底物未配对的嘌呤和配对的嘧啶间的磷酸二酯键。作为一种强有力的几乎通用的RNA特异性切割工具,它不但在体外可以作为限制性内切酶,在体内也可以作为RNA基因水平的失活剂。尽管在体外实验中,10-23脱氧核酶表现出良好的生物学活性,但是在生物体内,其催化活性受多种因素限制而显著降低,脱氧核酶在体内可被核酸酶降解,而且体内的二价离子（如Mg2+）浓度较低,限制其催化活性的发挥。因此,如何得到高活性、高稳定性的脱氧核酶,以实现其巨大的应用潜力是关于脱氧核酶研究的重要方向。目前针对结合臂部分的修饰,虽提高了稳定性,但催化活性一般有所降低,而对催化结构域的化学修饰,迄今没有发现能提高催化速率的化学修饰方法。我们根据其它课题组的研究成果,结合针对核酶进行的化学修饰,深入分析10-23脱氧核酶催化结构域的碱基结构和组成,设计了全新的修饰策略,将关注点集中在9个嘌呤碱基的五元环部分,因为这部分含有一个7-氮原子,它具有成氢键能力,参与核酸高级结构的形成。而且,这样众多的氮原子与其他功能基之间形成复杂的相互作用,参与构建10-23脱氧核酶的催化结构域。在这些与7-氮原子相关的相互作用中,有些相互作用可能是有利于催化构象的形成,而有些相互作用是不利的因素。因此,对它进行结构改造会对催化活性带来很大的影响。我们用7-去氮-脱氧腺苷和7-去氮-脱氧鸟苷分别替换脱氧核酶催化区域的A5、A9、A11、A12、A15、G1、G2、G6和G14等嘌呤核苷,合成了9条修饰脱氧核酶并进行催化活性的评价,相应的kobs依次为:LKWQ01(0.0027±0.0003 min-1)、LKWQ02(0.0022±0.0003 min-1)、LKWQ03（nd）、LKWQ04（nd）、LKWQ05(0.0018±0.0001 min-1)、LKWQ18（nd）、LKWQ19（nd）、LKWQ20（nd）和LKWQ21(0.0007±0.0001 min-1),与原型脱氧核酶LKDZ01的kobs (0.0037±0.0007min-1)相比,催化活性降低甚至基本丧失,表明9个嘌呤碱基的7-氮原子确实在催化活性中发挥的作用都是有利的。为了探讨能否进一步优化这个7．氮原子的作用，利用8-氮-7-去氮-脱氧鸟苷的引入，将7．氮原子迁移到8．位，在G1、G2、G6和G14进行替换，合成了4条修饰脱氧核酶，相应的k依次为：LKwQ06（nd）、LKwQ07(O 0041±O 0002mln-1)、LKwQ08（nd）和LKwQ09(O 0108土O 0008 mln-1)，可见在G2和G14的替换表现出更好的活性，说明在这个两个位置，氮原子处于五元环的8位是更有利于催化反应的，更重要的是，这个结果说明10-23脱氧核酶的催化结构域有进一步修饰的空间。在此基础上，我们在8-氮-7-去氮-脱氧鸟苷的7位引入羟基，考察了7．羟丙基修饰对催化活性的影响，在G2和G14的修饰，得到的LKwQll(O 0081±O 0002mln-1)、LKwQl3(O.0068±O.0015 mln-1)催化活性进一步提高，证明功能基的引入可获得更加高效的脱氧核酶。这一结果为进一步修饰提供了先导结构和修饰位点。基于此策略，本课题组还成功获得了另一个先导结构8．氮．7．去氮．脱氧腺苷和修饰位点A9位。利用化合物7-氨丙基-8-氮杂-7-去氮脱氧腺苷在A9位修饰得到活性提高达12倍的LKDz21 fO 045±O 004min-1)。针对LKDZ21的研究，我们获得了关于LKDz21的构效关系：（1）利用7．氨丙基-7-去氮-脱氧腺苷在A9位的修饰得到LKwQ33(O.0167±O.0012 mln-1)，与LKDz21(O 045±O 004 mln-1)相比，活性大幅下降，表明先导化合物的8位氮原子和引入的功能基（氨基）对催化活性起协同作用。（2）考察7．氨丙基8．氮杂．7．去氮脱氧腺苷在A5、A9、A11、A12、A15、T8、c10、c13和G14位对于催化反应速率的贡献差异，结果除A9位得到LKDZ21(O 045±O.004mln-1)外，其它位置修饰的催化速率均小于原型脱氧核酶，证明A，位是提高催化活性的最佳修饰位点。（3）利用含7．羟丙炔基、7．氨丙炔基、以及7．苯乙炔基取代的8．氮．7．去氮-脱氧腺苷在A9位的修饰，考察了连接臂的柔性改变对于引入功能基作用的影响，结果相应得到的脱氧核酶LKwQ37(O.0111±O.0015min-1)、LY02(O 0179±O 0003 mln-1)和LY08(O.0075±O.0003 mln-1)比7-羟丙基、7．氨炔基、以及7．苯乙基取代的8-氮-7-去氮-脱氧腺苷在A9位的修饰活性均有所降低，表明连接臂的柔性是引入功能基发挥作用的保证，只有柔性的连接臂才能使功能基处于合适的空间位置，进而更大程度的展现其对催化构象的正向调整作用。（4）通过引入7-叔丁基苯乙基，与7-苯乙基修饰比较，考察空间拥挤效应对催化活性的影响，结果在A9位修饰得到的LKDz33(O 0153±O.00017min-1比7-苯乙基修饰得到的LKDz27 fO 0128±O（）(】18 min-1活性略有提高，表明其贡献的大小很可能与其带来的构象变化大小是正相关性的，但通过体积变化导致的空间拥挤效应对提高10-23脱氧核酶的催化能力是有限的，而羟基和氨基等可能通过与其它功能基之间的氢键作用，对构象优化的程度更大。（5）7-氨丙炔基、7．羟丙炔基、以及7．苯乙炔基取代的8．氮-7-去氮-脱氧腺苷，7．氨丙基-7-去氮．脱氧腺苷在其他位点的修饰结果进一步表明了A9位点对于所设计的核苷先导结构的唯一性。（6）最后考察了腺苷六元环部分的氨基对催化活性的作用，结果在A5、A”A11和A15位四个位置修饰得到的LKwQ22（nd）、LKwQ23（nd）、LKwQ24（nd）和LKwQ26(O.0013±O.0001 min-1)基本失去催化能力，表明这四个位置的6位氨基对脱氧核酶的活性催化构象的形成起到正面作用，应该保留；而在A。：位修饰的LKwQ25(O.0098±O（11 min。。）催化能力却升高，表明A12位氨基发挥的作用对脱氧核酶的催化能力是不利的，它的存在可能通过氢键等作用力不利于了最佳催化构象的形成。通过热稳定性试验和圆二色谱测定结果可知，本课题所设计的在10-23脱氧核酶催化结构域的修饰没有带来热稳定性和整体构象的变化，说明修饰所带来的催化速率的变化不是缘于热稳定性，而是影响了催化反应步骤。这是首次在催化结构域通过化学修饰获得催化速率的提高，表明10-23脱氧核酶催化结构域具有进一步优化的空间，催化区域的A9位、G2和G14位是可以进一步进行化学修饰的位点。本课题提出的核苷类似物先导结构和修饰位点，对催化速率的影响是缘于脱氧核酶的自身属性的改变，而非热稳定性等其它因素，为进一步设计高效脱氧核酶提供了理性指导作用，打破了目前针对10-23脱氧核酶的随机修饰的现状，为进一步获得高效脱氧核酶提供了新方向。从现实意义讲，10-23脱氧核酶虽在抗病毒、抗肿瘤和心血管疾病治疗等方面有发展为基因治疗药物的潜力，但受限于对二价金属离子的高度依赖，一直未能成药，本课题获得的高效10．23脱氧核酶的先导结构筛选，对于实现其作为基因治疗药物的价值具有重要意义。