注射用阿魏酸脂质体（冻干）药学研究

论文摘要

阿魏酸（ferulic acid,FA）是川芎、当归、升麻等多种具有活血化淤功效中药的有效成分之一。现代药理学研究表明FA具有明确的抗氧化、清除自由基、抗炎、抗细胞凋亡、抗血小板凝集和血栓,抗动脉粥样硬化作用,临床用于治疗脑卒中引起的缺血、缺氧,具有保护作用,能改善脑组织代谢。将FA制备成脂质体制剂,可以增强其体内的抗氧化效果,提高对脑缺血/再灌注损伤的保护作用。建立FA HPLC分析方法,线性浓度范围为0.31-15.5μg/mL。处方前研究表明:FA在弱酸性环境中稳定性大于酸性或碱性环境,在无水乙醇和蒸馏水中稳定性最好,4℃储藏条件稳定。FA在无水乙醇中溶解度最大,在水溶液中溶解度随pH增加而增加,但是在较强的碱性条件下,溶解度降低。电位滴定法测定pKa为pKa1=4.99,pK2=8.05。建立了FA紫外分光光度法,在浓度1.70-8.5μg/mL范围内线性关系良好。采用超速离心过滤法测定FAL包封率,对FA脂质体（FAL）处方及制备条件进行考察,最终确定处方为:混合磷脂（S-100:E-80,6∶1）:胆固醇,5∶1;药脂比1∶20,高压匀质机采用逐级增加方式,压力800bar,循环6次,流速35Hz,最终获得的包封率为74.5%。此外对醋酸梯度建立方法进行了探索,认为采用大孔吸附树脂可以代替排阻色谱法建立醋酸梯度,并且具有操作简单,成本低,效率高,可工业化的优点。孵育条件选择10min,室温。以复溶后包封率、外观、粒径、复溶的难易程度为指标,优化了冻干处方及工艺参数,并测定了混合物共熔点为-10.6℃。选择海藻糖和蔗糖做为冻干保护剂,处方为:海藻糖:磷脂:蔗糖为1∶2∶4,内加法加入冻干保护剂,磷脂浓度15mg/mL;冻干条件为:快速预冻-40℃,3h;一次干燥-25℃,10h;二次干燥:20℃,3h,室温6个月储存包封率及粒径无显著改变。评价冻干阿魏酸脂质体（FD-FAL）理化性质,复溶后平均粒径为139.1nm,zeta电位为+8.69,释放速度明显加快,7h内释药近80%。建立了FA体内检测的HPLC条件,考察了FD-FAL及FA溶液的体内药动学参数,FD-FAL的t1/2为0.47h,AUC为990.20μg·min/ml,Cl为72.71 ml/min;FA溶液的t1/2为0.29h,AUC为682.66μg·min/ml,Cl为105.48 ml/min。FD-FAL组与溶液组相比,t1/2,MRT显著延长,AUC0-2增加,清除速率降低。建立大鼠脑缺血/再灌注模型,以丹参注射液为阳性对照药物,考察FD-FAL体内抗氧化效果。结果FD-FAL可以显著提高脑缺血/再灌注大鼠脑内SOD活力,降低MDA含量,同时可降低二者的比值从而改善自由基与清除自由基酶之间的平衡,抑制自由基的损伤及其引起的脂质过氧化反应,对脑组织起保护作用。效果明显优于FA溶液组及阳性药物对照组。FD-FAL可显著减少脑梗死体积,效果优于溶液组及阳性药物对照组。FD-FAL可提高模型大鼠横木行走实验得分,对脑缺血/再灌注的保护作用显著高于FA溶液及丹参注射液。通过将FA制备成注射用冻干脂质体制剂,可以提高其在脑内的抗氧化效果,显著增强其对脑缺血/再灌注的保护作用,到达了预期的实验目的。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 1 缺血性脑卒中药物治疗研究进展
• 1.1 溶栓治疗
• 1.2 抗凝、抗血小板治疗
• 1.3 神经保护剂
• 1.4 扩张血管
• 2 阿魏酸的研究进展
• 2.1 药理学研究进展
• 2.2 FA的合成及改造
• 2.3 FA药动学及体内过程研究
• 3 脂质体技术在中药制剂中的应用进展
• 3.1 抗肿瘤方面的应用
• 3.2 抗菌方面的应用
• 3.3 在免疫调节方面的应用
• 3.4 在肝炎治疗中的应用
• 3.5 在神经系统疾病方面的应用
• 4 冷冻干燥技术在脂质体研究中的应用
• 4.1 冻干保护剂
• 4.2 冻干工艺
• 4.3 冻干品复水化过程
• 4.4 冻干脂质体的贮存条件
• 5 本课题立题依据及研究方案
• 第一章 阿魏酸处方前研究
• 1 阿魏酸（FA）体外分析方法的建立
• 1.1 实验仪器与材料
• 1.2 检测波长的确定
• 1.3 流动相的选择
• 1.4 专属性实验
• 1.5 标准曲线的绘制
• 1.6 精密度考察
• 1.7 重复性实验
• 1.8 稳定性考察
• 1.9 回收率试验
• 2 FA理化性质考察
• 2.1 实验仪器与材料
• 2.2 FA稳定性研究
• 2.3 FA溶解度测定
• 2.4 电位滴定法测定Pka
• 3. 讨论
• 4 小结
• 第二章 阿魏酸脂质体制备工艺研究
• 1 实验仪器与材料
• 2 FA紫外-可见分光光度分析方法的建立
• 2.1 标准曲线的绘制
• 2.2 精密度试验
• 2.3 回收率试验
• 3 超速离心过滤法测定FAL包封率
• 3.1 离心超滤管对药物的吸附
• 3.2 离心超滤管对空白脂质体的截流
• 3.3 超滤离心法分离空白脂质体与药物溶液物理混合物
• 3.4 不同离心转速对分离效果的影响
• 3.5 不同离心时间对分离效果的影响
• 3.6 FAL包封率的测定
• 4 大孔吸附树脂测定FAL的包封率
• 4.1 大孔吸附树脂对游离药物的吸附
• 4.2 大孔吸附树脂对空白脂质体的吸附
• 4.3 HPD450对空白脂质体和游离药物物理混合物的分离
• 4.4 FAL包封率的测定
• 5 FAL处方筛选
• 5.1 磷脂种类的选择
• 5.2 混合磷脂比例的考察
• 5.3 不同药脂比的考察
• 5.4 不同胆固醇用量的考察
• 6 工艺条件考察
• 6.1 压力范围的优化
• 6.2 压力增加方式的优化
• 6.3 循环次数的优化
• 6.4 流速的优化
• 7 醋酸梯度建立方法的考察
• 7.1 大孔吸附树脂的预处理
• 7.2 大孔吸附树脂对空白脂质体的吸附
• 7.3 大孔吸附树脂建立醋酸梯度的考察
• 8 主动载药条件的考察
• 8.1 孵育温度考察
• 8.2 孵育时间考察
• 9 讨论
• 10 小结
• 第三章 阿魏酸冻干工艺研究及理化性质评价
• 1 实验仪器与材料
• 2 处方筛选
• 2.1 冻干保护剂种类对包封率的影响
• 2.2 磷脂与冻干保护剂比例对包封率的影响
• 2.3 冻干保护剂的最终确定
• 2.4 磷脂浓度的考察
• 2.5 冻干保护剂加入方式的选择
• 3 冻干工艺的优化
• 3.1 预冻温度的选择
• 3.2 预冻方式的选择
• 3.4 干燥条件的选择
• 4 贮存条件的优化
• 5 理化性质评价
• 5.1 粒径测定
• 5.2 zeta电位的测定
• 5.3 体外释放研究
• 6 讨论
• 7 小结
• 第四章 阿魏酸脂质体冻干制剂的体内药动学及药效学研究
• 1 阿魏酸冻干脂质体（FD-FAL）药动学研究
• 1.1 实验仪器与材料
• 1.2 动物实验分组
• 1.3 血浆样品预处理
• 1.4 阿魏酸体内分析方法的建立
• 1.5 药动学参数计算
• 2 FD-FAL体内药效评价
• 2.1 实验仪器与材料
• 2.2 动物实验方案及模型的复制
• 2.3 神经功能损失评分
• 2.4 蛋白质含量的测定
• 2.5 SOD（超氧化物歧化酶）活力的测定
• 2.6 MDA（丙二醛）含量的测定
• 2.7 脑梗死体积的测定
• 2.8 横木行走测试
• 3 讨论
• 4 小结
• 全文结论
• 致谢