论文摘要
随着癌症发生率与死亡率的逐年上升,恶性肿瘤的防治己成为世界性的卫生战略问题。由于传统治疗方法的局限性日益凸现,新一代靶向治疗方法日益受到人们关注。其中,智能抗癌药物以其针对性强、效果显著、毒副作用小等突出优点成为21世纪抗肿瘤药物发展的新方向。以往曾经研究过的大量靶向治疗药物均因存在过强的免疫原性及毒副作用而无法应用于临床,而这也是靶向药物设计的关键与难点。有鉴于此,本课题试图研制一种具有良好特异性和安全性的高效抗癌智能药物。人体颗粒酶B（GrB）是由细胞毒T淋巴细胞和自然杀伤细胞产生的一种丝氨酸酯酶,能够通过多种途径高效诱导靶细胞死亡,在抗病毒感染、自身免疫、抗肿瘤免疫等过程中均发挥重要作用。人体促性腺激素释放激素（GnRH）是由下丘脑分泌的十肽激素,调节垂体性腺轴的内分泌作用。GnRH受体在多种腺癌细胞表面大量表达,而在垂体外正常组织则数量很少,使之成为腺癌治疗的理想靶点。本研究利用现代分子生物学技术,对人体颗粒酶B进行智能化设计与改造,构建表达融合蛋白,以期准确靶向杀伤一类GnRH受体（GnRHR）阳性的腺癌细胞。本课题首先对GrB原有的自身细胞结合位点的蛋白编码序列进行替换突变,消除其通过自身静电吸附.交换模式结合人体正常细胞,然后将此GrB突变基因（mGrB）与GnRH基因进行重组,构建mGrB-G4S-GnRH（mGrBLG）融合蛋白编码序列。该设计在不影响GrB细胞毒活性的前提下提高了融合蛋白靶向结合的准确性,从而降低了非特异性细胞杀伤导致的毒副作用。由于GnRH和GrB均为源于人体自身的正常蛋白,从根本上避免了异源蛋白带来的免疫原性问题。另外,利用G4S柔性短肽连接蛋白各功能基团,能够使其基本保持天然空间结构,防止被免疫系统错误识别,以致产生中和抗体而导致药物失效、甚至引发免疫过敏反应,从而使该融合蛋白的免疫原性最小化。本研究先后利用E.coli原核表达系统及Pichia pastoris酵母真核表达系统对目的蛋白进行了可溶性表达和分泌表达。为了保证工作的严谨性,本研究还同时构建、表达与制备了无突变GrB融合蛋白（GrBLG）、突变GrB蛋白（mGrB）和原始GrB蛋白（GrB）三种对照蛋白,以期全面考察目的蛋白及其各功能基团的生物活性。经亲和层析纯化,研究最终得到酵母分泌表达的4种蛋白GrB、mGrB、GrBLG和mGrBLG,其纯度经SDS-PAGE检测均约达90%。本课题对4种目的蛋白的生物学功能进行了多方面的分析。在利用合成的GrB特异性肽底物进行的检测中,毕赤酵母表达的4种蛋白均表现出与商品化的人重组GrB标准蛋白相似的酶促反应模式,即以浓度依赖的方式对特异性肽底物进行切割,并具有相似的酶促反应活性。结果显示,GrB结合位点的突变及其与靶向基团GnRH、亲和标签的融合并没有影响mGrB、GrBLG与mGrBLG中GrB基团的酶促生物活性。在体外细胞毒实验中,本研究分别检验了各蛋白在单独作用以及与氯喹协同作用下,对细胞的体外杀伤作用。结果显示:氯喹能够裂解靶细胞中的内涵体,从而释放内吞入胞的mGrBLG,使之发挥生物活性。在0.1～10000 ng/ml实验蛋白剂量范围内,mGrBLG蛋白在氯喹的协同作用下,对MCF-7（人乳腺癌细胞系,GnRHR+）表现出显著的杀伤作用(mGrBLG蛋白剂量达10μg/ml时,杀伤率为96.3%;蛋白IC50约34.1ng/ml);对HEK293（人胚肾细胞系,GnRHR+）具有一定的杀伤作用（mGrBLG蛋白剂量达10μg/ml时,杀伤率为5.9%）,但此作用弱于GrBLG（GrBLG蛋白剂量达10μg/ml时,杀伤率为13.2%）;而对CCC-ESF-1（人胚胎皮肤成纤维细胞系,GnRHR-）几乎未表现出杀伤作用（蛋白剂量达10μg/ml时,细胞存活率仍高于99%）。体外杀伤实验结果说明,mGrBLG对GnRHR-的人体正常细胞并不敏感;对GnRHR+的人体正常细胞具有一定的毒副作用,但与未经改造的GrBLG相比,在最高实验剂量10μg/ml时的细胞死亡率降低了55.3%,说明突变有效提高了mGrBLG对细胞杀伤的准确性、降低了蛋白的毒副作用;对GnRHR+恶性肿瘤细胞的杀伤率显著高于对GnRHR+正常细胞的杀伤率,这与两种细胞表面的GnRHR富集程度直接相关。在体外实验中,各实验细胞均以相同的概率结合mGrBLG蛋白,据此分析,在体内实验中,mGrBLG可能会表现出更低的毒副作用。进入体内循环系统后,mGrBLG与GnRHR的相互作用将遵循竞争性结合的原理。由于肿瘤细胞表面的GnRH受体数量远远多于正常细胞的受体数量,mGrBLG将以更大的概率结合于GnRH受体富集的肿瘤细胞,而对正常细胞表面GnRH受体的结合作用将会更低于体外实验水平。利用过量GrB抗体和过量商品化的GnRH短肽分别竞争性结合mGrBLG中的mGrB基团以及细胞表面的GnRH受体,以具体分析mGrBLG中两个结构域各自的功能。实验结果进一步证实mGrB为mGrBLG蛋白的杀伤效应基团,GnRH为其结合细胞表面GnRH受体的靶向基团。该结果也显示出连接短肽G4S促进了蛋白各部分的正确折叠和相对独立,进而维护了其各自正常的生物学活性。在mGrBLG协同氯喹的细胞杀伤实验中,肿瘤细胞MCF-7表现出明显的凋亡形态学特征,如染色体固缩、凋亡小体形成等,同时激发了细胞内caspase-3的活性。在caspase广泛抑制剂存在的情况下,mGrBLG仍能杀伤大于42%的MCF-7细胞。这些结果说明,mGrBLG同天然GrB一样,能够诱导caspase依赖及非依赖性的靶细胞凋亡,而这种多途径的细胞致死能力对于对抗肿瘤细胞中普遍存在的凋亡规避机制无疑具有重大意义。mGrBLG协同氯喹在体外细胞实验中初步表现出靶向特异杀伤一类GnRHR+腺癌的生物学活性,而其杀伤正常细胞的毒副作用和免疫原性己被最小化。GnRH受体富集的恶性肿瘤包括胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、前列腺癌、结肠癌、肝癌、肾癌、肺癌以及垂体瘤等,该类恶性肿瘤往往对化疗与放疗不敏感。因此,研制针对此类恶性肿瘤的新型特效的智能药物具有重要的现实意义。通过今后进一步开展肿瘤动物模型的体内药效学评价、临床前药理、药代、毒理、临床试验等更加深入的研究,mGrBLG有望成为一种高效、安全、特异靶向治疗一类GnRHR+恶性肿瘤的生物技术智能新药。
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标签：恶性肿瘤论文; 颗粒酶论文; 促性腺激素释放激素论文; 智能药物论文;