细胞分裂素与巨大芽孢杆菌B1301抑菌能力及其防治小麦纹枯病的关系

论文摘要

通过转座子诱变产生突变体是非常成熟的技术,Tn917为专性针对革兰氏阳性细菌转座子,已有不少成功的报道。本文利用Tn917转座子突变技术,通过改变芽孢杆菌细胞分裂素的产生量,以小麦纹枯病为防治对象,研究了细胞分裂素产量与芽孢杆菌防治植物病害能力的关系。从生姜块茎周围的土壤中分离得到一株产细胞分裂素的生防菌株巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）B1301,具有防治多种植物病害的功能。本研究使用的非穿梭性质粒pTV1来源于枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）PY143,携带转座子Tn917。通过电穿孔方法和原生质体方法将该质粒导入到野生巨大芽孢杆菌B1301中,利用高温消除质粒,实现转座子诱变,获得巨大芽孢杆菌B1301突变体库。通过继代培养,98%的突变菌株具有遗传稳定性,表明Tn917插入片段在大多数突变菌株中可以稳定遗传。PCR检测证明pTV1中的Tn917片段插入到巨大芽孢杆菌基因组中。通过萝卜子叶生物测定法,筛选到两株突变菌株B1301-22和B1301-6,其中突变菌株B1301-22产生细胞分裂素的能力提高,相同条件下萝卜子叶相对增重率比B1301提高了18.34%,而突变菌株B1301-6产生细胞分裂素的能力降低,相同条件下萝卜子叶相对增重率比B1301减少了9.30%。Southern杂交分析表明,Tn917在这2个突变菌株上的插入位点是随机的,插入为双拷贝。对2个突变菌株进行表型性状观察,表明与野生型B1301菌株无明显不同。采用平板对峙法测定野生菌株B1301、突变菌株B1301-22和B1301-6对禾谷镰孢菌（Fusarium graminearum）、小麦根腐病菌（Bipolaris sorokiniana）、棉花红腐病菌（Fusarium moniliforme）、棉枯萎病菌（Fusarium oxysporum f.sp.vasinfectum）、立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）、蔬菜灰霉病菌（Botrytis cinerea）、枣叶斑病菌（Alternaria sp）、棉花炭疽病菌（Colletotrichum gossypii）、小麦纹枯病菌（Rhizoctonia cerealis）9种植物病原真菌的抑菌能力。结果表明突变菌株B1301-22、B1301-6的抑菌能力与B1301的抑菌能力相比有明显减弱,甚至丧失抑菌能力。依据以上结果,推测Tn917的一个拷贝插入到与抑菌功能相关的基因中,造成菌株抑菌能力的下降;另一个拷贝则插入到与细胞分裂素产生相关的基因中,引起两种效应,即减少或提高细胞分裂素的产量。以禾谷丝核病原菌（Rhizoctonia cerealis）为靶标菌,盆栽条件下测定了2个突变菌株对小麦纹枯病的生物防治效果。细胞分裂素产量提高的突变菌株B1301-22对小麦纹枯病的防治效果显著高于野生菌株,相对于野生菌株防效提高了11.84%;细胞分裂素产量减少的突变菌株B1301-6对小麦纹枯病的防治效果明显低于野生菌株,相对于野生菌株B1301防效下降了40.34%。结果表明细胞分裂素与野生菌株B1301的病害防治活性有密切关系。2个突变菌株对小麦纹枯病菌等几种病原真菌的平板对峙抑菌能力都明显下降,但是B1301-22防治效果升高,B1301-6防治效果降低,进一步说明了细胞分裂素对野生菌株B1301防治植物病害的重要性。本研究还探索了不同碳源、氮源、起始pH值、温度、摇床转速等条件对突变菌株B1301-22产细胞分裂素的影响。结果表明,实验室摇床培养条件下,B1301-22产细胞分裂素的优化培养条件为:1%玉米粉,0.8%豆饼粉,培养温度28–30℃,培养基的初始pH值7.2,摇床转速180–200r/min。在培养温度30℃,摇床转速180r/min下,B1301-22在筛选得到的培养基上产生的细胞分裂素使萝卜子叶相对增重率比在基础培养基上培养提高21.60%。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 1 引言
• 1.1 芽孢杆菌在植物病害生物防治中的作用
• 1.1.1 拮抗作用（Antagonism）
• 1.1.2 诱导系统抗性（induced systemic resistance,ISR）
• 1.1.3 竟争作用
• 1.2 细胞分裂素的研究现状
• 1.2.1 植物源细胞分裂素
• 1.2.2 微生物源细胞分裂素
• 1.2.3 细胞分裂素与植物病害防治菌的关系
• 1.2.4 细胞分裂素作用机理
• 1.2.5 细胞分裂素的检测方法
• 1.3 转座子介导的遗传转化
• 1.3.1 转座子的类型
• 1.3.2 转座子的转座方式
• 1.3.3 转座子的遗传学功能（张霞,1999）
• 1.3.4 转座子Tn917 在分子生物学中的研究
• 1.3.5 转座子Tn917 的应用
• 1.4 目的意义和主要研究内容
• 1.4.1 目的意义
• 1.4.2 研究内容
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 菌株与质粒
• 2.1.2 供试病原菌
• 2.1.3 培养基
• 2.1.4 试剂
• 2.1.5 各种工具酶及其它药剂
• 2.1.6 仪器
• 2.2 方法
• 2.2.1 质粒pTV1 的提取与野生生防菌B1301 的转化
• 2.2.2 质粒pTV1 向野生生防菌B1301 的转化
• 2.2.2.1 质粒的电穿孔转化（孙良武等，1994）
• 2.2.2.2 原生质体转化（吴鹤龄等，1985）
• 2.2.2.3 质粒pTV1 的检测
• 2.2.3 转化子的转座诱变（Yaungman，1983；Nicholas，1986）
• 2.2.4 野生生防菌B1301 突变菌株的筛选
• 2.2.4.1 发酵液中细胞分裂素的初步分离纯化
• 2.2.4.2 突变菌株的筛选
• 2.2.4.3 萝卜子叶的测定
• 2.2.5 野生生防菌B1301 突变菌株分子检测
• 2.2.6 突变菌株生物学特性研究
• 2.2.6.1 突变菌株性状观察
• 2.2.6.2 突变菌株遗传稳定性检测
• 2.2.6.3 生长曲线测定（周洪友，2005）
• 2.2.6.4 不同培养时间对菌株产生细胞分裂素的影响
• 2.2.6.5 平板对峙试验
• 2.2.7 小麦纹枯病盆栽防病试验
• 2.2.8 突变菌株B1301-22 产细胞分裂素培养条件的探索
• 2.2.8.1 碳源对产细胞分裂素的影响
• 2.2.8.2 碳源添加量对产细胞分裂素的影响
• 2.2.8.3 氮源对产细胞分裂素的影响
• 2.2.8.4 氮源添加量对产细胞分裂素的影响
• 2.2.8.5 温度对产细胞分裂素的影响
• 2.2.8.6 pH 对产细胞分裂素的影响
• 2.2.8.7 转速对产细胞分裂素的影响
• 3 结果与分析
• 3.1 质粒pTV1 向野生生防菌B1301 的转化
• 3.1.1 电穿孔转化条件的探索
• 3.1.1.1 电压对转化效率的影响
• 3.1.1.2 电容对转化效率的影响
• 3.1.1.3 电阻对转化效率的影响
• 3.1.1.4 不同量的质粒对转化效率的影响
• 3.1.2 原生质体转化
• 3.2 质粒pTV1 向野生生防菌B1301 的转化检测
• 3.2.1 质粒DNA 的电泳酶切验证
• 3.2.2 质粒pTV1 向野生生防菌B1301 的转化与检测
• 3.3 Tn917 在野生生防菌B1301 转化子中的转座诱变
• 3.4 野生生防菌B1301 突变菌株的筛选
• 3.5 巨大芽孢杆菌突变菌株基因检测
• 3.5.1 转座子Tn917 的PCR 验证
• 3.5.2 Southern 杂交分析
• 3.6 突变菌株生物学特性研究
• 3.6.1 突变菌株性状观察
• 3.6.1.1 芽孢杆菌培养性状的观察
• 3.6.1.2 芽孢染色
• 3.6.1.3 遗传稳定性测定
• 3.6.1.4 生长曲线测定
• 3.6.1.5 不同培养时间对菌株产生细胞分裂素的影响
• 3.6.1.6 拮抗实验
• 3.6.1.7 盆栽试验
• 3.7 突变菌株B1301-22 产细胞分裂素培养条件的影响
• 3.7.1 碳源对B1301-22 突变菌株产细胞分裂素的影响
• 3.7.2 碳源不同含量对B1301-22 突变菌株产细胞分裂素的影响
• 3.7.3 氮源对B1301-22 突变菌株产细胞分裂素的影响
• 3.7.4 氮源不同含量对B1301-22 突变菌株产细胞分裂素的影响
• 3.7.5 温度对B1301-22 突变菌株产细胞分裂素的影响
• 3.7.6 pH 对B1301-22 突变菌株产细胞分裂素的影响
• 3.7.7 转速对B1301-22 突变菌株产细胞分裂素的影响
• 4 讨论
• 4.1 质粒pTV1 向野生生防菌B1301 的转化
• 4.2 质粒pTV1 转化验证
• 4.3 质粒pTV1 转座
• 4.4 细胞分裂素与B1301 防治植物病害能力的关系
• 4.5 细胞分裂素的作用
• 4.6 抑菌能力与病害防治之间的关系
• 5 结论
• 参考文献
• 致谢
• 研究生期间发表论文