古菌FHA结构域蛋白的转录调控机制研究

论文摘要

古菌中包含有Forkhead （FHA）结构域的转录因子的功能和靶调控基因目前尚很不清楚。极端嗜热古菌Sulfolobus tokodaii str.7中ST0829蛋白C端含有FHA结构域,是丝苏氨酸蛋白激酶ST1565蛋白磷酸化反应底物,N端含有Zn finger-RanBP结构域,通常可以结合DNA序列。因此,ST0829是一个潜在的转录因子。本课题通过构建S. tokodaii str.7启动子文库,运用细菌单杂交技术等方法,筛选和验证转录因子ST0829调控的下游靶基因,并进一步研究磷酸化作用对于古菌转录调控的影响,主要取得了以下几个方面的结果：（1）构建完成了S. tokodaii str.7启动子文库。（2）利用细菌单杂交筛选S. tokodaiistr.7启动子文库,发现了含有FHA结构域的ST0829蛋白调控的下游靶基因—古菌鞭毛蛋白操纵子（FlaG, FlaF, FlaH, FlaI, FlaJ）。（3）通过体外EMSA、SPR实验,体内CHIP实验验证了ST0829蛋白可以特异性结合这个鞭毛蛋白操纵子启动子序列（ST2519p）。（4）发现了ST0829蛋白被ST1565蛋白磷酸化之后,DNA结合活性显著降低。（5）ST0829蛋白能够与RNA聚合酶β亚基相互作用,并具有转录自调控现象。本研究首次鉴定了古菌FHA蛋白转录因子调控的下游靶基因,并通过体内体外实验验证了这种特异性的相互作用,进一步发现了磷酸化在转录方面的调控作用。这些工作对于我们深入理解古菌适应极端环境的机制提供了线索。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 缩略语
• 1 前言
• 1.1 古菌概述
• 1.2 FHA结构域蛋白
• 1.2.1 真核生物中的FHA结构域蛋白
• 1.2.2 细菌中的FHA结构域蛋白
• 1.2.3 古菌中的FHA结构域蛋白
• 1.3 丝/苏氨酸蛋白激酶
• 1.3.1 真核生物中的丝/苏蛋白激酶
• 1.3.2 细菌中的丝/苏蛋白激酶
• 1.3.3 古菌中的丝/苏蛋白激酶
• 1.4 古菌鞭毛蛋白
• 1.5 课题研究的目的意义与目标
• 1.6 课题研究主要内容
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 供试菌株
• 2.1.2 酶、试剂和试剂盒
• 2.1.3 供试抗生素
• 2.1.4 引物及寡核苷酸
• 2.1.5 供试质粒
• 2.1.6 其余缓冲液、试剂
• 2.2 方法
• 2.2.1 PCR扩增反应
• 2.2.2 分子生物学基本操作
• 2.2.3 蛋白质的表达纯化和透析
• 2.2.4 构建古菌S.tokodaii str.7启动子文库
• 2.2.5 细菌单杂交实验
• 2.2.6 磷酸化实验
• 2.2.7 聚丙烯酰胺凝胶阻滞实验
• 2.2.8 表面等离子共振实验
• 2.2.9 体内染色质免疫共沉淀实验
• 2.2.10 细菌双杂交实验
• 3 结果与分析
• 3.1 S.tokodaii str.7启动子文库构建完成
• 3.2 寻找到FHA结构域蛋白ST0829调控的下游靶基因—古菌鞭毛蛋白操纵子
• 3.3 体内体外实验验证ST0829蛋白可以结合在古菌鞭毛蛋白操纵子的启动子（ST2519p）序列上
• 3.3.1 聚丙烯酰胺凝胶阻滞实验（EMSA）验证蛋白质-DNA相互作用
• 3.3.2 表面等离子共振技术（SPR）验证蛋白质-DNA相互作用
• 3.3.3 体内染色质免疫共沉淀实验（CHIP）验证蛋白质-DNA相互作用
• 3.4 磷酸化作用对ST0829蛋白结合DNA活性的影响
• 3.4.1 ST0829能够被激酶ST1565及突变体蛋白质磷酸化
• 3.4.2 ST0829蛋白被激酶STl 565磷酸化后DNA结合活性降低
• 3.4.3 ST0829蛋白被磷酸集团供体ACP磷酸化后DNA结合活性降低
• 3.5 细菌双杂交实验证明ST0829蛋白和RNA聚合酶-β亚基有相互作用
• 3.6 ST0829蛋白有转录白调控现象（EMSA,CHIP）
• 4 总结与讨论
• 4.1 总结
• 4.2 讨论
• 4.3 研究展望
• 参考文献
• 论文发表情况
• 致谢