论文摘要
1.背景与目的:自从1904年德国莱比锡病理学家Marchand首次提出动脉粥样硬化（Atherosclerosis, AS）一词以来,历经一个多世纪,人们对AS的认识已逐步深入。然而,目前动脉粥样硬化发病率和致死率仍然很高,AS导致的心脑血管疾病仍是当今人类死亡的首位原因之一。AS是一种退行性和增生性病变,与衰老有着密切的关系。而我国拥有世界上最庞大的老年人群,AS的迁延性和难愈性不仅严重危害了老年患者的健康,还导致医学资源连续消耗。研究衰老在AS发生发展中的机制对于预防和治疗AS有着重要的意义,有较大的学术价值和社会效应。AS的发病机制十分复杂,目前认为,血管内皮结构和功能损伤可能是动脉粥样硬化的病理生理基础,内皮损伤己被证明是AS最早期的改变,而损伤血管有效地再内皮化可以维持血管内皮细胞单层的完整性,预防AS的发生。目前促进损伤血管修复的措施主要有以下几种:戒烟等生活方式的改善;应用药物如他汀类药物、血管紧张素转换酶抑制剂、沙坦类药物、胰岛素增敏剂等抗氧化药物保护血管内皮细胞功能;血管内皮生长因子抑制内皮细胞凋亡;血管内皮祖细胞（Endothelial Progenitor Cells,EPCs）移植。以EPCs为基础的细胞疗法修复损伤血管已成为大家关注的方向。EPCs由造血干细胞分化而来,是血管内皮细胞的前体细胞,表达干细胞及内皮细胞相关抗原,主要来源于骨髓、胎肝、脐血和脾脏。传统观点认为血管损伤后修复主要依赖于邻近成熟内皮细胞的迁移和生长增殖。而新近的研究表明骨髓和外周血中EPCs是血管内皮损伤修复的最重要的机制之一。在血管内皮损伤后,EPCs从骨髓中动员并归巢于损伤血管内皮局部,分化为成熟内皮细胞,加快损伤血管再内皮化,抑制病理性新生内膜的形成,在血管内皮损伤修复中起着重要的作用。EPCs的数量和活性受到多种生理和病理因素的影响,包括年龄、高血压、高糖、氧化LDL、慢性肾功能衰竭等等。研究表明单纯的年龄增加会使大鼠EPC动员减少,增殖、黏附和迁移能力降低,并且发现EPCs参与损伤血管再内皮化的过程具有年龄依赖性,即年轻供体EPCs移植促进血管内皮损伤再内皮化的作用更明显,老龄供体EPCs该效应不明显。衰老导致EPCs的功能受损、数量减少,可能是老年患者血管损伤后再内皮化能力下降的原因。如何有效抑制EPCs衰老,促进老年患者损伤血管有效再内皮化成为目前急需解决的问题。Klotho （ Kl）基因是Kuro等在1997年发现的与衰老相关的新基因。Kl基因在小鼠中的表达缺失导致类似于人类衰老的各种表型变化,例如动脉内膜增厚、中膜钙化、动脉硬化和骨质疏松、肺气肿、糖和能量代谢异常等。Kl基因主要在肾远曲小管上皮细胞上表达。目前,Kl预防衰老的机制尚不十分清楚,有研究证实在Kl基因变异的小鼠,随着机体的逐渐衰老,骨髓、外周血EPCs数量会明显降低,提示Kl基因表达水平与EPCs关系密切。本课题拟研究小鼠增龄对Kl表达的影响,探讨Kl对EPCs数量、生物学功能及其参与血管损伤后再内皮化的影响,初窥Kl抑制EPCs衰老的可能的信号通路。2.方法:2.1小鼠增龄与Kl表达水平及EPCs功能的关系2.1.1检测不同月龄小鼠EPCs数量和功能雄性C57BL/6小鼠,按照月龄分为2月龄、12月龄、20月龄三组。采用内皮细胞选择性培养基培养和诱导分化密度梯度离心法获的小鼠骨髓源性单个核细胞,以获得小鼠骨髓源性EPCs,并分别通过acLDL-DiI和FITC-UEA-I荧光双染鉴定、流式细胞仪检测细胞表面干细胞抗原及内皮细胞特异性抗原鉴定,和用免疫组化法检测细胞表面内皮细胞特异性抗原来鉴定。分别采用acLDL-DiI和FITC-UEA-I荧光双阳性细胞计数、MTT分析、改良的Boyden小室、黏附细胞计数来检测不同年龄EPCs数量、增殖、迁移和黏附能力。2.1.2检测不同月龄小鼠肾脏Kl mRNA和外周血Kl蛋白水平采用RT-PCR法检测不同月龄小鼠肾脏Kl mRNA的表达,用Western-blot法检测不同月龄小鼠外周血Kl蛋白水平,分析不同月龄小鼠Kl水平与EPCs数量及功能的相关性。2.2 Kl对老龄小鼠EPCs部分生物学功能的影响2.2.1观察Kl对体外培养的老龄小鼠EPCs部分生物学功能的影响20月龄小鼠骨髓源性EPCs与不同浓度的Kl蛋白孵育,分别采用acLDL-DiI和FITC-UEA-I荧光双阳性细胞计数、MTT分析和改良的Boyden小室法来检测其数量、增殖、迁移能力的变化。2.2.2初步探讨Kl抑制EPCs衰老的可能的信号通路采用Western-blot法检测不同浓度Kl孵育老龄小鼠p53、p21的表达和Akt的磷酸化水平,分析Kl影响EPCs衰老的机制。2.3 Kl促进老龄小鼠损伤血管再内皮化的研究主要观察Kl对老龄小鼠血管损伤后EPCs动员及修复损伤内皮的影响。采用非显微外科法建立小鼠（20月龄）颈动脉损伤模型。在小鼠颈动脉损伤后各时点（术前、术后1天、术后3天、术后7天和术后14天）获取外周血,采用流式细胞仪检测外周血EPCs数量。在小鼠颈动脉损伤后第3天,采用流式细胞仪检测Kl处理组、Kl抗体处理组外周血EPCs的数量;14天后通过Evans blue染色检测损伤动脉再内皮化情况,通过HE染色检测损伤动脉新生内膜增生情况。3.结果第一部分:培养7天的小鼠骨髓单个核细胞呈梭形或纺锤状,与内皮细胞形态相似,绝大多数细胞可摄取acLDL-DiI和与UEA-I结合,流式细胞仪检测显示这些细胞既有干细胞抗原Sca-1的高表达,又有内皮特异性标记物VEGFR-2的高表达,免疫组化检测显示这些细胞还高表达内皮特异性标记物vWF。荧光双染计数2M、12M、20M月龄小鼠EPCs数量,发现随着月龄的增加,EPCs数量明显减少。采用MTT法检测不同月龄小鼠骨髓源性EPCs增殖能力,用Boyden迁移小室法测定其迁移能力,用粘附细胞计数测量其粘附能力,结果发现,随着月龄的增加,小鼠骨髓源性EPCs的粘附功能、迁移功能、增殖功能明显下降。分别采用RT-PCR和Western-blot法检测不同月龄小鼠肾脏Kl mRNA和外周血Kl蛋白水平,结果显示Kl mRNA和外周血Kl蛋白水平随着月龄的增加而显著性降低。同时分析显示Kl水平与EPCs的数量和粘附功能、迁移功能和增殖功能具有相关性。第二部分:体外细胞培养实验中,荧光双染计数显示,Kl刺激浓度依赖性增加老龄小鼠骨髓单个核细胞分化成EPCs的数量;MTT分析显示,Kl刺激浓度依赖性增强EPCs的增殖能力;改良的Boyden小室分析显示,Kl浓度依赖性增加迁移的EPCs数量。采用Western-blot法测定不同浓度的Kl蛋白处理后的EPCs细胞的p53/p21表达水平,发现p53/p21呈Kl蛋白浓度依赖性下降;以P-Akt与Akt的比值来代表EPCs Akt磷酸化的水平,发现Akt的磷酸化水平随着Kl蛋白浓度的增加而逐渐下降。第三部分:非显微外科手术方法损伤小鼠颈动脉后,取损伤动脉Evans blue染色观察,损伤动脉内皮完全剥脱。小鼠颈动脉损伤后,采用流式细胞仪检测外周血EPCs数量显示,小鼠颈动脉损伤后1天、3天和7天,外周血EPCs数量明显高于假手术组,外周血EPCs数量在动脉损伤后3天达到高峰。采集术后第3天Kl处理组和Kl抗体处理组小鼠的外周血,检测其EPCs数量,结果显示:与颈动脉损伤组相比较,Kl处理组的循环Kl明显升高,而Kl抗体处理组无明显上升。术后第14天,损伤血管Evans blue染色显示,在Kl处理组,损伤血管再内皮化的面积明显高于对照颈动脉损伤组,Kl抗体处理组的再内皮化的面积与颈动脉损伤组相比无明显差异。HE染色后应用Image ProPlus软件用来测量新生内膜、中膜面积,利用内膜面积和中膜面积的比值来评价内膜新生,结果显示,Kl处理组内膜增生程度较对照组及Kl抗体处理组明显降低。4.结论4.1不同月龄小鼠肾脏Kl mRNA表达、外周血Kl蛋白水平与EPCs的数量、迁移、增殖、黏附功能相关,且随小鼠月龄的增加下降;4.2在本研究浓度范围内,Kl蛋白可能参与体外培养的老龄小鼠骨髓单个核细胞分化,促进骨髓单个核细胞分化成为EPCs,呈浓度依赖性提高其迁移能力和增殖能力;4.3在本研究浓度范围内,Kl蛋白可浓度依赖性降低体外培养的EPCs的p53/p21的表达以及Akt的磷酸化水平,可能部分通过下调Akt活性,降低p53/p21水平,抑制细胞衰老;4.4在本研究浓度及时间范围内,Kl蛋白可以升高老龄小鼠动脉损伤后EPCs的循环数量,增强EPCs的动员,促进老年小鼠损伤动脉再内皮化,降低新生内膜增生。
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