论文摘要
肝纤维化（hepatic fibrosis）是各种因素导致的慢性肝病,如慢性病毒性（乙型、丙型肝炎病毒）、寄生虫性、免疫性、毒物损伤性肝病的创伤愈合反应,具有很高的发病率和致死率,严重危害着人类的健康。肝纤维化的病理特征为细胞外基质（extracellular matrix,ECM）的过度沉积,是合成和降解失去平衡的结果。肝星状细胞（hepatic stellate cell,HSC）的激活是肝纤维化形成过程的关键,其中活化的肝星状细胞的大量增殖和胶原的过度生成是导致细胞外基质大量沉积的主要原因。目前的研究认为肝纤维化病变经过适当的积极治疗有希望延缓甚至逆转,而发展到肝硬化则难以逆转。但到目前为止,临床上还没有公认的确切有效的抗肝纤维化药物,因此深入研究肝纤维化形成的分子机制,有助于形成新的治疗策略和研制抗纤维化新药。ND701是从药用植物丹参（西藏产）中提取分离的酚酸类化合物,生理作用非常广泛,具有收敛、抗氧化、抗炎抗菌抗突变等的能力,并在保肝、抗肿瘤、抑制血小板聚集,加强胶原溶解方面起着重要的作用。山东省天然药物工程技术研究中心已将其开发研制为具有自主知识产权的治疗慢性迁延性肝炎肝纤维化“一类”新药（化学药）。本文研究了ND701对肝纤维化的治疗作用并探讨了其可能的作用机制。1.建立牛血清白蛋白致大鼠免疫性肝纤维化模型,根据体重、血清白蛋白Alb和纤粘连蛋白FN水平随机分组,大鼠灌胃给药,连续给药15d、30d眼眶采血,测定血清丙氨酸氨基转移酶ALT、天门冬氨酸氨基转移酶AST、白蛋白/总蛋白ALb/TP、总胆红素Tbi、碱性磷酸酶ALP,观察肝功能变化。连续灌胃给药60d处死动物,检测血清透明质酸HA、层粘连蛋白LN、Ⅲ型前胶原肽PcⅢ以及肝组织羟脯氨酸Hyp,观察肝纤维化状态的变化。取相同部位的肝小叶组织,用4%的多聚甲醛固定,并进行常规石蜡包埋切片,苏木精-伊红染色检测损伤程度,Masson染色观察肝组织纤维化程度。结果发现,经过反复基础免疫与激发可以导致大鼠肝细胞受损和纤维化形成,表现为肝功能指标血清转氨酶、ALP、Tbi水平升高,ALb/TP比值增大;肝纤维化指标血清HA、LN、PcⅢ含量增加,肝组织Hyp含量增加;病理切片显示肝细胞大量坏死、胞浆水肿、核固缩、尼氏体消失,胞浆嗜酸性增强甚至核膜破裂,仅见细胞轮廓,纤维组织大量增生。灌胃给药ND701 15d、30d发现,15mg/kg、30mg╱kg浓度的ND701明显改善肝功能,降低转氨酶活性、ALP水平,灌胃给药60d发现,15mg/kg、30 mg/kg的ND701可明显改善纤维化程度,降低血清HA、LN、PcⅢ含量、降低肝组织Hyp含量（与模型对照组比较,P＜0.05或0.01）。病理切片显示,肝细胞损伤有明显的减轻,细胞变性较轻、同样视野肝细胞坏死数量降低,肝组织中胶原纤维的沉积明显减少。2.体外培养人肝星状细胞HSC,通过观察细胞贴壁及形态改变来检测ND701对细胞激活的影响,采用自发激活模型SRB法检测ND701对细胞增殖的影响,酶联免疫法检测ND701对细胞因子转化生长因子β1（transforming growth factor-β1,TGF-β1）和结缔组织生长因子（connective tissue growth factor,CTGF-）以及细胞外基质纤粘连蛋白（fibronectin,FN）的影响。结果显示ND701（1μg/ml、2μg╱ml、4μg/ml、8μg/ml、16μg╱ml）呈浓度依赖性抑制肝星状细胞的激活,ND701（2μg/ml、4μg/ml、8μg/ml、16μg/ml）)抑制激活的HSC增殖,并抑制其合成TGF-β1（差异不显著）、CTGF-和FN（具有显著性差异P＜0.05或0.01）。以上结果显示,ND701能够改善纤维化大鼠的肝功能、抑制肝星状细胞的激活与增殖并能有效抑制肝纤维组织增生,因此ND701对大鼠肝纤维化有确切的治疗作用,其机制可能与抑制TGF-β1、CTGF-的表达有关。