导读:本文包含了噬菌体载体论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:CRISPR-Cas9技术,抗生素耐药性,噬菌体杀菌技术,噬菌体包装技术
噬菌体载体论文文献综述
刘鸿博[1]（2019）在《利用温和噬菌体载体递呈CRISPR-Cas9系统靶向清除细菌耐药性的研究》一文中研究指出研究背景:近些年来,泛耐药菌和多重耐药菌的检出率不断上升,针对一线抗生素的耐药率逐渐升高。特别是随着超级耐药菌的出现,抗感染治疗面临无药可用的局面。细菌耐药性的快速流行已成为一个亟待解决的全球性卫生问题。耐药基因往往定位于细菌质粒,具备极强的跨菌种水平转移能力。目前针对泛耐药菌和超级耐药菌的治疗方式及其有限,尚无有效的技术手段阻断耐药性的扩散转移。耐药菌感染治疗、防控等领域亟需新技术和新策略。CRISPR-Cas9基因编辑技术来源于细菌的特异性免疫机制CRISPR系统,能够对目的DNA实现序列特异性的剪切。近年来已有研究报道将CRISPR系统包装至温和噬菌体中,通过噬菌体递呈CRISPR系统,致死性地剪切细菌靶基因。这些研究提供了利用CRISPR工具对抗耐药菌的思路,但还遗留很多缺陷。首先,之前的研究主要通过温和噬菌体递呈CRISPR靶向细菌染色体的策略进行杀菌,缺少靶向质粒策略抗耐药菌效果的深入分析,尤其缺少体内实验数据。其次,当前研究显示的噬菌体递呈CRISPR技术杀菌效力有限,远远低于传统的烈性噬菌体杀菌技术,达不到实用水平。另外,噬菌体包装技术需要改进以避免抗性筛选标记被引入包装后的噬菌体基因组,并提高包装噬菌体的效率和对新噬菌体的适用性。最后,以往研究只评价了1~2天内包装CRISPR-Cas噬菌体的抗菌能力,还需要在更长的观测时间里进行持续观测和分析。研究目的:细菌耐药性主要由耐药质粒进行介导和传播。利用原核CRISPR-Cas9基因编辑技术清除细菌耐药质粒,能够恢复抗生素的杀菌效力,并阻断细菌耐药性的传播。利用更加高效的原核载体技术,携带靶向细菌耐药质粒的CRISPR-Cas9系统更加高效的向耐药菌递呈,将大大增加该系统在抗耐药菌领域的实际应用潜力。本研究将建立CRISPR-Cas9高效清除细菌耐药性技术。设计并构建特异性CRISPR-Cas9系统来分析靶向清除NDM-1耐药质粒的效果。在此基础上,我们利用温和噬菌体作为CRISPR-Cas9系统的高效递呈载体。通过研发新型温和噬菌体包装CRISPR-Cas9技术,实现CRISPR系统的“一步法”包装,探索从温和噬菌体分离到完成包装的技术流程。利用噬菌体递呈CRISPR-Cas9系统,在一系列的体内外实验中检验细菌耐药性的清除效率,并分析联合抗生素抗耐药菌策略。通过持续监测对耐药菌生长的抑制效果,分析噬菌体递呈CRISPR-Cas9抗菌策略是否能避免新的细菌耐受突变的产生,是否具有比烈性噬菌体直接杀菌策略更加持久的抑菌效力。研究方法:建立针对超级耐药基因bla_(NDM-1)的CRISPR-Cas9靶点spacer文库,构建靶向NDM-1质粒的CRISPR-Cas9系统质粒。构建携带NDM-1质粒的耐药大肠杆菌模型,采用定量PCR及荧光信号检测等方法分析CRISPR-Cas9系统清除NDM-1质粒的效率,药敏实验检验耐药质粒清除后细菌耐药表型的变化。通过上述实验验证CRISPR-Cas9系统高效清除细菌耐药质粒的能力。设计引入抗性筛选的新型重组噬菌体筛选系统,建立“一步法”温和噬菌体整合CRISPR-Cas9技术。采用该包装技术改造一株新分离的大肠杆菌温和噬菌体,使其递呈CRISPR-Cas9系统,并靶向剪切携带bla_(NDM-1)靶点的质粒。利用包装CRISPR-Cas9噬菌体侵染携带靶质粒的大肠杆菌,分析噬菌体递呈的CRISPR-Cas9系统清除细菌耐药性的能力,包括PCR检测靶质粒的清除效果,定量PCR分析靶质粒清除效率,菌落计数法统计耐药细菌的敏感化率。利用包装CRISPR-Cas9噬菌体介入细菌耐药质粒的转化、接合等水平转移途径,评价噬菌体递呈CRISPR-Cas9系统清除细菌耐药质粒在阻断细菌耐药性传播扩散方面的效果。建立温和噬菌体递呈CRISPR-Cas9联合抗生素的抗耐药菌策略,在包括生物膜、小鼠皮肤感染模型、小鼠肠道感染模型等体内外条件下检验该策略的耐药性清除及耐药菌杀灭效力。对联合抗耐药菌策略的杀菌效力进行至少1周时间内的连续监测,观察是否会出现细菌对该策略的耐受突变,并和烈性噬菌体直接杀菌策略的耐受突变相比较。采用全基因组测序分析细菌产生噬菌体耐受突变的机制。研究结果:(1)建立了针对bla_(NDM-1)基因的CRISPR-Cas9系统靶点文库,包含20条特异性spacer序列。构建了靶向剪切bla_(NDM-1)基因的特异性原核CRISPR-Cas9系统质粒。(2)利用CRISPR-Cas9系统清除大肠杆菌的NDM-1质粒,使产NDM-1耐药模式菌变为bla_(NDM-1)阴性,恢复细菌对亚胺培南及其它β-内酰胺类抗生素的敏感性。(3)证明原核CRISPR-Cas9质粒转化耐药菌可以高效清除大肠杆菌中携带的NDM-1质粒。证明无论是天然的NDM-1大质粒还是重组NDM-1高拷贝质粒均可以在12 h内实现大于99%的细胞内清除率。(4)建立了新的噬菌体包装CRISPR-Cas9技术,首次探索完成了大肠杆菌温和噬菌体从分离测序到“一步法”包装CRISPR-Cas9系统的整套技术流程。(5)检验了噬菌体递呈CRISPR-Cas9系统在体外条件下清除靶质粒的效率,发现在8小时内能实现大于99%的耐药质粒清除率。提出利用噬菌体递呈CRISPR-Cas9清除细菌耐药性联合抗生素杀死耐药菌的策略,在体外实验中降低了约10~6倍的耐药大肠杆菌数量,优于已报道研究中所采用的细菌染色体靶向策略。(6)噬菌体递呈CRISPR-Cas9抗菌技术能够减少细菌耐药质粒在环境中的释放和积累,相比烈性噬菌体在8小时内减少了约98.7%的耐药质粒释放。噬菌体递呈CRISPR-Cas9抗菌技术可阻断耐药质粒在细菌间的接合转移,减少了98%的pNDM-1接合子菌落数量,抑制细菌耐药性的传播扩散。(7)首次在形成生物膜的耐药菌中评价噬菌体递呈CRISPR系统技术,并证明该技术能够在成熟生物膜中清除约50%的耐药质粒,将抗生素的最低生物膜清除浓度降低50%。(8)首次在体内实验中评价CRISPR靶向细菌耐药质粒的策略,噬菌体递呈CRISPR系统能够在小鼠皮肤感染模型和小鼠肠道感染模型中发挥清除细菌耐药质粒的作用并联合抗生素实现10~5~10~6倍的耐药大肠杆菌数的降低,效果优于已报道的CRISPR靶向细菌染色体策略。(9)在体外条件下进行长时间杀菌效果监测,烈性噬菌体杀菌策略在24小时内快速引发细菌的噬菌体耐受现象。而192小时内未观察到细菌对包装CRISPR-Cas9噬菌体联合抗生素杀菌策略的新耐受现象。体内条件下,在小鼠皮肤和肠道耐药菌感染模型中持续监测该策略,烈性噬菌体策略在2-3天内出现细菌的耐受,而7天内未观察到细菌对包装CRISPR-Cas9噬菌体联合抗生素杀菌策略的耐受。(10)通过对耐受突变株的全基因组测序,揭示大肠杆菌MG1655形成烈性噬菌体vB_253耐受的机制是在fepA基因位点出现碱基突变;大肠杆菌MG1655形成卡那霉素耐受的机制是在fusA基因位点出现碱基突变。而噬菌体递呈CRISPR-Cas9系统清除细菌耐药质粒联合抗生素杀菌的策略不会导致细菌出现上述基因突变。研究结论:本研究提出了利用噬菌体递呈CRISPR-Cas9系统清除细菌耐药性的策略。在方法学上新建了温和噬菌体“一步法”包装CRISPR-Cas9系统技术。利用噬菌体递呈CRISPR-Cas9系统高效靶向清除细菌耐药质粒的策略,破坏了介导细菌耐药性的质粒,阻断细菌耐药性的传播,降低菌群环境中的耐药基因水平,具备开发成为细菌耐药性防控新技术的潜力。在耐药菌治疗方面,噬菌体递呈CRISPR-Cas9清除细菌耐药性并联合应用抗生素在体内外一系列实验中实现了强大的杀灭耐药菌能力。该策略不仅解决了由耐药基因介导的细菌耐药性问题,使失效的抗生素疗法重新焕发生机,还避免了杀菌过程中可能出现的耐受突变,有望成为一种有效杀灭耐药菌的新方法,在抗耐药菌领域有巨大的应用潜力。(本文来源于《军事科学院》期刊2019-06-03）
吕雪峰,刘钧松,李志慧,王华,许志林[2]（2009）在《利用噬菌体载体展示抗体文库技术研究进展》一文中研究指出1985年,美国Missouri大学的Smith GP将外源基因插入丝状噬菌体(Filamentous bacterio-phage,fd)的基因组,使目的基因编码的多肽以融合蛋白的形式展示,从而创建了噬菌体展示技术〔1〕。1994年McCaffery等(本文来源于《中国人兽共患病学报》期刊2009年11期）
王冰,钟雪云,秦艳芳,钟瑛,于莉娜[3]（2004）在《通过噬菌体载体筛选胶质瘤细胞结合的内化短肽》一文中研究指出目的 :寻找与神经胶质细胞瘤细胞系SWO - 38特异性结合并内化的短肽序列。方法 :利用噬菌体随机 12肽库对肿瘤细胞进行 5轮全细胞筛选 ,并分析筛选后单克隆对肿瘤细胞的特异性结合能力。提取单克隆DNA ,测序 ,推导出短肽序列。结果 :5轮筛选后的噬菌体库及所挑选 13个单克隆中有 10个对胶质瘤细胞有特异性的结合 ,并测序得到两条重复性高的多肽序列。结论 :通过噬菌体随机肽库对肿瘤细胞进行全细胞筛选得到的噬菌体多肽能高特异性与肿瘤细胞结合 ,可作为肿瘤导向药物研究的载体(本文来源于《中国病理生理杂志》期刊2004年05期）
程云,罗清华,周继文,杨守纯,韩风连[4]（1996）在《抗HBV Pre S2单链噬菌体抗体基因在噬菌体载体中的克隆及初步表达》一文中研究指出目的利用基因重组技术构建ＨＢＶ前Ｓ２单链抗体基因并使其在大肠杆菌中永生化和表达活性的抗ＨＢＶ前Ｓ２单链抗体（ＳｃＦｖ）。方法和结果利用基因重组技术，在构建抗ＨＢＶ前Ｓ２３Ｂ９ＳｃＦｖ基因的基础上，在此基因中引入限制性内切酶位点，克隆到噬菌体表达载体－ｐＣＡＮＴＡＢ５噬菌粒中，经亲和筛选得到２株阳性重组克隆，诱导表达产物在特异性阻断ＥＬＩＳＡ实验中具有一定阻断亲本３Ｂ９单抗与ＨＢＶ前Ｓ２抗原的结合能力，阻断率２２％－３３％。结论抗ＨＢＶ前Ｓ２ＳｃＦｖ在噬菌体中克隆和表达成功，为下一步继续表达单一的单链抗体并使其人源化打下了良好的物质基础。(本文来源于《中华肝脏病杂志》期刊1996年02期）
程云,罗清华,周继文,杨守纯,韩风连[5]（1995）在《HBV PreS2单链噬菌体抗体基因在噬菌体载体中的克隆及初步表达》一文中研究指出ＨＢＶＰｒｅＳ２单链噬菌体抗体基因在噬菌体载体中的克隆及初步表达程云，罗清华，周继文，杨守纯，韩风连，戎广亚，曹阳，季伟３Ｂ９单抗是一株抗ＨＢｖＰｒｅＳ２抗原的单抗。作者利用基因重组技术，在成功构建抗ＨＢＶＰｒｅＳ２３Ｂ９单抗单链可变区抗体（ＳｃＦＶ...(本文来源于《中华微生物学和免疫学杂志》期刊1995年01期）
程云,罗清华,周继文,杨守纯,韩风连[6]（1994）在《抗HBV PreS2单链噬菌体抗体基因在噬菌体载体中的克隆及初步表达》一文中研究指出本文利用基因工程技术,在成功构建抗HBV PreS2 3B9mAb单链可变区抗体(ScFV)基因的基础上,在389 ScFv基因中引入限制性内切酶位点,克隆的噬菌体表达载体pCANTAB5噬菌粒中。经转染TG1(本文来源于《传染病信息》期刊1994年03期）
支纪祖,柴建华[7]（1992）在《P1噬菌体载体系统》一文中研究指出Pl噬菌体载体系统可用于75～100kb大小DNA插入片段的克隆、分离、扩增和回收,每微克载体DNA可产生10~5个重组克隆。P1载体在大肠杆菌中以质粒形式存在,操作比较方便。该载体系统可以避免基因组DNA在宿主中发生重排和缺失。(本文来源于《国外医学(分子生物学分册)》期刊1992年06期）
沈天翔,余茂効,贾盘兴[8]（1991）在《枯草芽孢杆菌噬菌体载体的构建》一文中研究指出以φ105DI:1t为原始株构建的重组噬菌体φ105S35和φ105S36具有自主侵染能力和溶源化特征。其基因组内插入的1kb片段上的cat,基因赋予二者所在宿主以氯霉素抗性。在两株噬菌体中插入位点相同,即原φ105DI:1t的SmaI酶切片段D、E之间,但插入片段在二者中的定向相反。与 cat 基因同时引入的单一 BamHI 和 XbaI 位点提供了外源 DNA 的插入位置。重组噬菌体 DNA 可高效转染枯草芽孢杆菌原生质体。因此φ105S35和φ105S36可作为枯草芽孢杆菌系统的载体而被利用。(本文来源于《微生物学报》期刊1991年05期）
李云,刘颐屏,朱宝泉,童村[9]（1989）在《噬菌体载体在抗生素基因克隆中的应用》一文中研究指出一、前言 链霉菌是一类经济价值很高的微生物。在目前,它已经成为遗传上最引人关注的微生物之一。在几十年前,放线菌只是作为放射遗传及突变的基础研究或应用研究的对象,(本文来源于《中国抗生素杂志》期刊1989年02期）
Barners,W,M,,陈玉梅[10]（1983）在《用单链噬菌体载体克隆DNA》一文中研究指出丝状单链DNA大肠杆菌型噬菌体M 13、fd及f1,近来被作为一类新的DNA克隆载体而发展起来了,它的优点显着超过其它载体,包括其它两类大肠杆菌寄主的克隆载体:质粒和噬菌体λ。本综述描述单链噬菌体载体的生物学及应用方法以及测量插入DNA大小和排列方向的快速方法,特别是单链载体对DNA定序和离体位点定向诱变(本文来源于《遗传工程》期刊1983年01期）
噬菌体载体论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
1985年,美国Missouri大学的Smith GP将外源基因插入丝状噬菌体(Filamentous bacterio-phage,fd)的基因组,使目的基因编码的多肽以融合蛋白的形式展示,从而创建了噬菌体展示技术〔1〕。1994年McCaffery等
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
噬菌体载体论文参考文献
[1].刘鸿博.利用温和噬菌体载体递呈CRISPR-Cas9系统靶向清除细菌耐药性的研究[D].军事科学院.2019
[2].吕雪峰,刘钧松,李志慧,王华,许志林.利用噬菌体载体展示抗体文库技术研究进展[J].中国人兽共患病学报.2009
[3].王冰,钟雪云,秦艳芳,钟瑛,于莉娜.通过噬菌体载体筛选胶质瘤细胞结合的内化短肽[J].中国病理生理杂志.2004
[4].程云,罗清华,周继文,杨守纯,韩风连.抗HBV Pre S2单链噬菌体抗体基因在噬菌体载体中的克隆及初步表达[J].中华肝脏病杂志.1996
[5].程云,罗清华,周继文,杨守纯,韩风连.HBVPreS2单链噬菌体抗体基因在噬菌体载体中的克隆及初步表达[J].中华微生物学和免疫学杂志.1995
[6].程云,罗清华,周继文,杨守纯,韩风连.抗HBVPreS2单链噬菌体抗体基因在噬菌体载体中的克隆及初步表达[J].传染病信息.1994
[7].支纪祖,柴建华.P1噬菌体载体系统[J].国外医学(分子生物学分册).1992
[8].沈天翔,余茂効,贾盘兴.枯草芽孢杆菌噬菌体载体的构建[J].微生物学报.1991
[9].李云,刘颐屏,朱宝泉,童村.噬菌体载体在抗生素基因克隆中的应用[J].中国抗生素杂志.1989
[10].Barners,W,M,,陈玉梅.用单链噬菌体载体克隆DNA[J].遗传工程.1983
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