镁离子添加提高抗癌药物安丝菌素P-3产量的研究

论文摘要

安丝菌素是一类从橙色珍贵束丝放线菌橙色亚种（Actinosynnema pretiosum ATCC 31565）中分离得到的,与美登醇的结构和抗肿瘤活性相似的聚酮类抗生素,其中以安丝菌素P-3（AP-3）活性最显著。尽管AP-3具有很好的抗肿瘤活性,对其发酵生产也有一些报道,但是低下的发酵效价仍然严重限制了AP-3的进一步药理研究及其应用。金属离子对微生物生长和次级代谢产物至关重要,因金属离子添加被认为是一种简单有效的策略,但是未应用于AP-3的生产。因此本研究以提高AP-3产量为目的,首先考察了不同的二价金属离子对发酵过程的影响,筛选出效果最好的金属离子Mg2+。然后通过添加时间、添加浓度的优化实验确定最适发酵条件,使AP-3的产量达到了85 mg/L,是对照组的3倍。在此基础上,本研究进一步分析镁离子添加对前体、酶活及生物合成基因的影响。在酶水平,测定了聚酮类抗生素生物合成过程中关键酶甲基丙二酰CoA羧基转移酶和甲基丙二酰CoA异构酶的比活,发现它们均有不同程度的提高。同时检测到,当安丝菌素P-3产量增加时,其生物合成前体丙二酰CoA和甲基丙二酰CoA的含量显著降低,从而确定了它们在AP-3生物合成过程中的关键作用。进一步通过实时荧光定量PCR （qRT-PCR）方法,在转录水平跟踪AP-3生物合成相关基因的表达量的高低对镁离子的响应；数据表明,结构基因asm14, asm24和asm43,以及调节基因asm39和asm40都是上调的,与AP-3的产量呈正相关性。本研究表明添加镁离子提高AP-3产量的方法简便有效,为其它大环内酯类抗生素的发酵生产及大规模培养提供了参考依据。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
• 1.1 抗生素的发酵生产
• 1.1.1 碳、氮源及磷酸盐对次级代谢生物合成的影响
• 1.1.2 金属离子对次级代谢生物合成的影响
• 1.1.3 生物合成前体的供应
• 1.1.4 大环内酯类抗生素生物合成前体相关的重要酶
• 1.2 安丝菌素的生物活性及其生物合成途径
• 1.2.1 安丝菌素的发现和同系物
• 1.2.2 生物活性
• 1.2.3 生物合成途径
• 1.3 安丝菌素发酵的研发进展
• 1.4 立题目的及意义
• 1.5 本论文主要研究内容
• 第二章 金属离子添加对安丝菌素P-3产量的影响
• 2.1 前言
• 2.2 材料与仪器
• 2.3 实验方法与步骤
• 2.3.1 培养方法
• 2.3.2 细胞干重的测定
• 2.3.3 残糖的测定
• 2.3.4 安丝菌素P-3的检测
• 2.3.5 发酵液中安丝菌素P-3的鉴定
• 2.4 结果与讨论
• 2.4.1 金属离子对AP-3产量的影响
• 2.4.2 镁离子添加时间及浓度对AP-3产量的影响
• 2.4.3 镁离子添加对胞内镁离子浓度的变化的影响
• 2.5 小结
• 第三章 镁离子添加对生物合成途径的酶活及前体积累的影响
• 3.1 前言
• 3.2 材料与仪器
• 3.3 实验方法与步骤
• 3.3.1 细胞粗提液的制备
• 3.3.2 各个酶比活的测定
• 3.3.3 前体的测定
• 3.4 结果与讨论
• 2+添加对前体代谢相关酶活的影响'>3.4.1 Mg²⁺添加对前体代谢相关酶活的影响
• 2+添加对胞内代谢物积累的影响'>3.4.2 Mg²⁺添加对胞内代谢物积累的影响
• 3.5 小结
• 第四章 镁离子添加对安丝菌素生物合成相关基因表达的影响
• 4.1 前言
• 4.2 材料与仪器
• 4.3 试验方法与步骤
• 4.3.1 RNA提取与反转录
• 4.3.2 扩增条件与标准扩增曲线
• 4.3.3 实时荧光定量PCR（qRT-PCR）
• 4.4 实验结果与讨论
• 4.4.1 RNA提取
• 4.4.2 引物扩增效率与特异性
• 4.4.3 镁离子添加对AP-3生物合成相关基因表达水平的影响
• 4.5 小结
• 第五章 结论与展望
• 5.1 结论
• 5.2 展望
• 参考文献
• 致谢
• 附录
• 论文与专利发表情况