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初生乌骨鸡肝脏差异显示ESTs的筛选及分析

2020-11-22阅读(693)

初生乌骨鸡肝脏差异显示ESTs的筛选及分析

论文摘要

乌骨鸡是我国独特的家禽品种,是分布广泛的古老鸡种之一。丝羽乌骨鸡以其独特的外貌特征和药用、营养及观赏价值为中外家禽育种工作者所重视。家禽品种间和个体间的性状差异本质上都是由于基因种类的差异和基因表达量的差异所致。对同一个体不同组织或不同品种的相同组织的基因表达差异进行比较研究,可获得与生命过程相关的信息,揭示不同性状的发生发展机理。同时为研究乌骨鸡独特性状的形成机理提供重要的信息,并为进一步研究和开发利用乌骨鸡这一独特地方品种打下基础。 本试验分别以1日龄丝羽乌骨鸡（SK）、常羽乌骨鸡（NP）、苏禽蛋鸡（SQ）、爱拔益加肉鸡（AA）肝脏为研究材料,期望在排除饲养条件等环境因素对基因表达的影响下,比较初生蛋鸡、肉鸡和乌骨鸡基因表达上的差异。 本试验采用26碱基的三个锚定引物与24个随机引物之间共72个组合的逆转录PCR反应对1日龄丝羽乌骨鸡、常羽乌骨鸡、苏禽96型蛋鸡、AA肉鸡肝脏总RNA进行DDRT-PCR分析,并利用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳结合银染技术分离DDRT-PCR产物,共获得四个品种间差异条带251条。经过PCR再扩增、电泳检测和纯化,共得到差异显示的cDNA片段220条（重扩增率为87.6%）。经SSCP检测获得198个重扩增产物表现为单一cDNA的带型,单一条带率为90%。经过基因芯片杂交扫描,比较综合扫描数据获得8个真实的差异表达cDNA片段,委托上海生物工程公司克隆测序,获得4个ESTs序列。4个差异显示ESTs较短,且经1%琼脂糖电泳检测显示这些条带比非差异显示条带弱,推测差异表达的基因表达丰度低。 四个差异显示ESTs去除质粒污染序列后向Genbank提交,获得登陆号DQ003271-DQ003274。经与鸡基因组比对,分别进行了定位。具体定位是DQ003271:5号染色体;DQ003272:3号染色体;DQ003273:线粒体;DQ003274:19号染色体。其中DQ003271为家鸡新的EST,推测其功能与包含卷曲螺旋结构的蛋白的表达有关。其余3个为家鸡已知表达序列标签,其中DQ003272在机体免疫功能上发挥作用,DQ003273可能影响细胞有氧呼吸和氧化还原代谢,DQ003274可能与控制细胞分化和发育有关。 肝脏是“物质代谢中枢”,其表达的基因及合成的蛋白质种类占生物体内所有基

论文目录

  • 中文摘要
  • ABSTRACT
  • 符号说明
  • 前言
  • 1.文献综述
  • 1.1 乌骨鸡的药用价值和营养价值研究
  • 1.2 乌骨鸡特异性状研究
  • 1.3 基因表达差异的研究方法
  • 1.3.1 研究基因表达差异的传统方法
  • 1.3.2 差异显示PCR技术
  • 1.3.3 差异显示技术与其他寻找差异表达基因方法的联合应用
  • 1.3.4 mRNA差异显示技术的衍生技术
  • 1.3.5 mRNA差异显示技术的应用
  • 1.4 表达序列标签的研究及应用
  • 1.5 基因芯片简介
  • 1.6 本试验的目的和意义
  • 2.材料和方法
  • 2.1 试验材料
  • 2.1.1 试验动物和样品
  • 2.1.2 差异显示引物
  • 2.1.3 所需试剂及试剂盒
  • 2.1.4 常用试剂的配制
  • 2.1.5 主要仪器设备
  • 2.2 试验方法
  • 2.2.1 四个品种鸡肝脏差异表达cDNA的筛选
  • 2.2.2 差异表达cDNA片段真实性的验证
  • 2.2.3 初生乌骨鸡鸡肝脏差异表达cDNA片段克隆和测序
  • 2.2.4 特异表达序列标签的生物信息学分析
  • 3.试验结果与分析
  • 3.1 肝脏组织总RNA的提取及纯化
  • 3.2 差异显示逆转录PCR（DDRT-PCR）产物的电泳结果
  • 3.3 差异片段的切取
  • 3.4 差异片段的再扩增与回收
  • 3.5 SSCP筛选结果
  • 3.6 基因芯片杂交剔除假阳性结果
  • 3.6.1 芯片杂交伪色图
  • 3.6.2 基因芯片扫描结果
  • 3.7 差异表达片段克隆测序结果
  • 3.8 初生乌骨鸡差异表达序列标签的分析鉴定
  • 3.8.1 序列递交结果
  • 3.8.2 相似性搜索
  • 4.分析与讨论
  • 4.1 总RNA的抽提和DNASEⅠ处理
  • 4.2 差异显示PCR
  • 4.3 差异条带的回收和再扩增
  • 4.4 SSCP
  • 4.5 基因芯片杂交
  • 4.6 序列测定
  • 4.7 扩增现象
  • 4.8 序列标签的电子延伸及定位
  • 4.9 对应的基因组序列分析
  • 4.10 差异显示的基因及其编码蛋白质的功能
  • 5.小结
  • 主要参考文献
  • 致谢
  • 附录
  • 附录1 所用上游随机引物序列信息
  • 附录2 芯片的质量控制及芯片杂交所需试剂
  • 附录3 芯片杂交剔除假阳性
  • 附录4 作者简介

    • 相关论文文献

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