论文摘要
研究背景：真菌性角膜溃疡为全球最主要的致盲性眼病,高发于以农业为主的发展中国家,我国是真菌性角膜溃疡的高发地区,近几年来真菌性角膜溃疡的报道研究越来越多,相关的临床流行病学调查显示其发病率已上升到感染性角膜病的首位,因此,真菌性角膜溃疡的防治课题已成为我国致盲性眼疾的重要临床课题。通常情况下,真菌感染时很少侵犯正常角膜,但当角膜上皮组织被破坏,角膜基质层直接与真菌接触时,真菌就能通过破损处破坏角膜上皮下层以及基质层,导致真菌性角膜溃疡。因此,角膜上皮和基质细胞在激活角膜的固有免疫反应和抵抗真菌入侵中有重要作用。众多研究已经证明了TLR是人体固有免疫系统激活的关键因子,位于细胞膜的TLR识别来自细胞外部的病原体。但是病原微生体为了避免被识别,有其他侵入和通过上皮细胞层的方式,但是正常情况下真菌体内的感染率并不高,这说明在避过TLR的识别后,机体一定还有其他的方式来识别入侵真菌。NOD受体蛋白家族能识别细胞内的危险信号,启动固有免疫系统,它代明了细胞内同样有防御监测手段。NOD受体是目前的研究热点之一,但是关于它在角膜细胞中的表达,在抗真菌过程中的作用以及它与TLR的相互关系目前鲜有报道。目的：研究细胞内模式识别受体核苷酸结合的寡聚结构域NOD受体NOD1、NOD2在角膜细胞中的表达及其激活角膜细胞固有免疫过程中的作用,并探讨它与Toll样受体TLR4在此过程中的相互关系。方法：体外培养永生化人角膜上皮细胞（THCE）和永生化人角膜基质细胞（THSF）,实验细胞分为6组,分别更换DMEM培养液、LPS刺激液（1μg/ml）、DAP刺激液（10μg/ml）、MDP刺激液（10μg/ml）、LPS（1μg/ml）和DAP（10μg/ml）联合刺激液、LPS（1μg/ml）和MDP（10μg/ml）联合刺激液,于刺激后1h,3h,6h,12h,24h分别收取细胞上清以及细胞。用ELISA法测定上清中的TNF-α和IL-6的分泌,用实时RT-PCR检测角膜细胞中NOD1、NOD2和TLR4的mRNA表达,以及抗菌肽hBD2和LL37的mRNA的表达。应用SPSS13.0统计分析软件,数据均以均数±标准差表示,组内比较采用t检验,各组间的比较采用方差分析,P<0.05认为差异有统计学意义。结果：在相应配体刺激下角膜细胞中NOD1、NOD2的表达呈时间依赖性上调,并能引起细胞培养物上清液中IL-6和TNF-α的分泌增多,以及抗菌肽LL37和hBD2的表达增加。联合刺激组比单独刺激组的表达量明显增高,TLR4和NOD受体间表现出协同作用。结论：这些结果提示角膜细胞中的NOD1、NOD2和TLR4这两种胞内外模式识别受体介导的固有免疫信号传导通路参与了角膜上皮细胞的固有免疫反应,在角膜上皮细胞的抗真菌反应中起到一定作用,NOD1、NOD2在角膜细胞中表达并能激活其固有免疫系统,诱导其分泌促炎症细胞因子。NOD2于TLR4在激活角膜细胞固有免疫系统,诱导其分泌促炎症细胞因子的过程中具有协同作用,为今后免疫治疗提供了新的思路和靶点。