几种不同鱼类肥胖基因的克隆与鲤肥胖基因的表达研究

论文题目: 几种不同鱼类肥胖基因的克隆与鲤肥胖基因的表达研究

论文类型: 博士论文

论文专业: 动物遗传育种与繁殖

作者: 戴汉川

导师: 龙良启

关键词: 鱼类,肥胖基因,克隆与表达

文献来源: 华中农业大学

发表年度: 2005

论文摘要: 自从人和小鼠的肥胖基因克隆后,肥胖基因一直成为国内外研究的热点。肥胖基因编码的蛋白质(leptin)是反映体内脂肪含量的重要信号因子,leptin主要作用于下丘脑的特异受体,通过下丘脑进行摄食调控和维持能量代谢的平衡,leptin还对机体的免疫应答,繁殖功能,神经内分泌等功能具有重要的作用,具有广泛的生物学效应。现在已经克隆出了人、鼠、猪等动物的肥胖基因,并对其生物功能和表达特点进行了深入的研究。而有关鱼类的ob基因及其功能的研究很少见相关报道。鱼类品种繁多,不同品种的鱼类具有不同的摄食习性,并且鱼类体内脂肪的含量、摄食量以及饱食感与其摄食习性均有较大程度的差异,而对鱼类ob基因的研究将有利于阐明不同品种鱼类的摄食习性与机体的脂肪含量、摄食量以及饱食感之间的关系,对研究鱼类摄食调控的分子机理具有重要意义。本研究试图克隆不同摄食习性鱼类的ob基因,研究该基因在鱼体内和体外的表达特点,为研究鱼类ob基因的功能奠定基础。主要研究工作和结果如下: 1.几种不同鱼类肥胖基因的克隆 提取不同摄食习性鱼类肠系膜脂肪组织的RNA,包括杂食性鱼类:鲤、鲫;草食性鱼类:草鱼、团头鲂;滤食性鱼类:鳙、鲢;肉食性鱼类:青鱼、乌鳢、大口鲇、鳗鲡、史氏鲟。利用RT-PCR技术从鲤肠系膜脂肪组织中扩增出鲤肥胖基因的cDNA编码序列,将其克隆至pMD18-T载体进行序列测定。测序结果表明,几种不同摄食习性鱼类的ob基因编码区均由438个核苷酸组成,编码146个氨基酸,几种不同鱼类ob基因之间仅有2-4个核苷酸发生变异,导致1-2个氨基酸发生改变。鱼类ob基因的核苷酸和氨基酸的同源性均达到99%,与Genebank中ob基因序列的同源性进行比较,ob基因具有很强的保守性,鲤ob基因与人、猪、小鼠核苷酸同源性分别为:84%、86%、95%,氨基酸的同源性分别为84%、82%、96%。 2.鲤不同组织和不同胚胎发育阶段ob基因的表达 提取鲤不同组织(心脏、脾脏、肝脏、肾脏、肌肉、脑、脂肪)和不同发育阶段胚胎(卵巢、桑椹期、囊胚、原肠胚、神经胚、肌肉效应期、心跳期、出苗前期、出苗期)的RNA,利用RT—PCR方法对其进行检测,结果表明,鲤ob基因在鲤不同组织中均有表达,在肝脏和脂肪组织中的表达量较高,在其他组织中也有一定的表达;鲤ob基因在未受精卵和不同的胚胎发育阶段均有有表达。由于未进行定量RT-PCR,本研究尚不能确定鲤ob基因在不同的胚胎发育中是否具有发育性变化。人和小鼠的ob基因主要在脂肪组织中表达,在胚胎中也有表达,本研究表明鲤ob基因的表达与人和小鼠相比具有较大的差异。 3.鲤ob基因的表达节律及不同生理条件对ob基因表达的影响 本研究由两部分组成。试验Ⅰ:鲤ob基因在不同生理条件下的表达,将40尾鲤按体重随机分成4组,每组10尾,分别设置为正常对照组、饥饿组,饱食组和高

论文目录:

摘要

Abstract

第1章 文献综述

1.1 肥胖基因的研究进展

1.1.1 肥胖基因的基本结构

1.1.1.1 小鼠肥胖基因的结构

1.1.1.2 人ob基因的结构

1.1.1.3 猪ob基因的结构

1.1.1.4 鸡的ob基因结构

1.1.1.5 ob基因的突变

1.1.2 肥胖基因受体

1.1.2.1 ob受体基因的结构和功能

1.1.2.2 ob-R基因的表达

1.1.2.4 leptin受体的信号传导机制

1.1.3 肥胖基因的表达

1.1.3.1 肥胖基因的分布

1.1.3.2 肥胖基因表达的节律性变化

1.1.4 肥胖基因表达的调控

1.1.4.1 内分泌对Leptin分泌的影响

1.1.4.1.1 胰岛素对leptin表达的影响

1.1.4.1.2 糖皮质激素对leptin表达的影响

1.1.4.1.3 生长激素对leptin表达的影响

1.1.4.1.4 性激素对leptin的影响

1.1.4.2 摄食对leptin基因表达的影响

1.1.4.3 膳食结构对leptin基因表达的影响

1.1.4.4 运动对leptin基因表达的影响

1.1.4.5 其他因素对leptin表达的影响

1.1.5 leptin调节的中枢与外周作用

1.1.5.1 leptin调节的中枢作用

1.1.5.2 leptin调节的外周作用

1.1.6 leptin的生物学功能

1.1.6.1 leptin与能量代谢

1.1.6.2 leptin与生殖发育

1.1.6.3 leptin与免疫功能

1.1.6.4 lepti与细胞因子

1.1.6.5 leptin与妊娠和胎儿的发育

1.1.6.6 leptin与造血功能

1.1.6.7 leptin对组织器官的作用

1.1.6.7.1 leptin对胰腺的作用

1.1.6.7.2 leptin对肝脏的作用

1.1.6.7.3 leptin对骨代谢的影响

1.1.6.7.4 leptin对其他组织的其他作用

1.1.6.8 leptin抵抗现象

1.1.7 leptin在肥胖治疗上的应用

1.1.8 leptin在畜牧养殖上的应用前景

第2章 几种不同鱼类肥胖基因的克隆

2.1 研究目的和意义

2.2 材料与方法

2.2.1 材料

2.2.1.1 质粒与菌株

2.2.1.2 培养基

2.2.1.3 酶、Marker及试剂盒

2.2.1.4 引物

2.2.1.5 主要试剂及溶液的配制

2.2.2 方法

2.2.2.1 不同摄食习性鱼类脂肪组织总RNA的提取

2.2.2.2 不同摄食习性鱼类脂肪组织总RNA的纯化

2.2.2.3 ob片段的扩增

2.2.2.4 RT-PCR产物的电泳检测

2.2.2.5 RT-PCR产物的回收与纯化

2.2.2.6 RT-PCR产物的克隆

2.2.2.7 感受态细胞的制备(氯化钙法)

2.2.2.8 连接产物的转化

2.2.2.9 重组质粒的快速鉴定

2.2.2.10 质粒的提取

2.2.2.11 重组质粒的酶切鉴定

2.2.2.12 鱼类ob的测序

2.2.2.13 鱼类ob与其他动物ob的同源性分析

2.3 结果与分析

2.3.1 肠系膜脂肪组织总RNA的提取

2.3.2 不同鱼类ob基因的RT-PCR扩增

2.3.3 重组质粒的酶切鉴定

2.3.4 重组质粒的序列测定

2.3.5 鱼类肥胖基因的序列分析

2.4 讨论

2.5 小结

第3章 鲤肥胖基因在不同组织和不同胚胎发育阶段的表达

3.1 研究目的和意义

3.2 材料与方法

3.2.1 材料

3.2.1.1 试验动物

3.2.1.2 主要试剂

3.2.1.3 引物

3.2.2 方法

3.2.2.1 鲤不同组织、不同胚胎发育阶段总RNA的提取

3.2.2.2 鲤不同组织、不同胚胎发育阶段总RNA的纯化

3.2.2.3 鲤ob基因在不同组织和不同胚胎发育阶段的表达

3.2.2.4 RT-PCR产物的电泳检测

3.3 结果与分析

3.3.1 鲤不同组织中ob基因的表达

3.3.2 鲤ob在不同胚胎发育阶段中的表达

3.4 讨论

3.5 小结

第4章 鲤肥胖基因的表达节律及不同生理条件对肥胖基因表达的影响

4.1 研究目的和意义

4.2 材料与方法

4.2.1 材料

4.2.1.1 试验动物

4.2.1.2 主要试剂与试剂盒

4.2.2 方法

4.2.2.1 鲤高脂饲料的配制

4.2.2.2 不同摄食状态下鲤leptin的表达

4.2.2.3 鲤leptin的昼夜分泌规律

4.2.2.4 血清中血糖、总胆固醇、甘油三酯的测定

4.2.2.5 血清中Leptin、胰岛素的测定

4.2.2.6 数据处理

4.3 结果与分析

4.3.1 不同生理条件下鲤leptin的表达

4.3.2 鲤leptin的昼夜分泌表达规律

4.4 讨论

4.5 小结

第5章 鲤肥胖基因在大肠杆菌中的表达及生物学活性分析

5.1 研究目的和意义

5.2 材料与方法

5.2.1 材料

5.2.1.1 试验动物及饲料

5.2.1.2 质粒与菌株

5.2.1.3 培养基

5.2.1.4 酶、Marke及试剂盒

5.2.1.5 SDS-PAGE相关溶液

5.2.1.6 Western-blot相关溶液

5.2.1.7 包涵体提取相关溶液

5.2.2 方法

5.2.2.1 原核表达质粒的构建

5.2.2.2 重组质粒的诱导表达

5.2.2.3 SDS-PAGE检测

5.2.2.4 Western-blot分析

5.2.2.5 包涵体的提取

5.2.2.6 包涵体的纯化与复性

5.2.2.7 小鼠肥胖模型的制备

5.2.2.8 重组leptin对小鼠的影响

5.2.2.9 血清中血糖、总胆固醇、甘油三酯的测定

5.2.2.10 血清胰岛素的测定

5.2.2.11 数据处理

5.3 结果与分析

5.3.1 重组质粒的酶切鉴定

5.3.2 重组质粒的PCR鉴定

5.3.3 表达产物的SDS-PAGE检测

5.3.4 表达产物的Westernblot分析和包涵体的提取

5.3.5 小鼠肥胖模型的建立

5.3.6 leptin对小鼠摄食量的影响

5.3.7 leptin对小鼠体重的影响

5.3.8 leptin对小鼠血清相关生化指标和体脂的影响

5.4 讨论

5.4.1 重组表达载体的构建

5.4.2 鲤ob基因表达包涵体的提取与纯化

5.4.3 重组鲤leptin的生物学活性

5.5 小结

第6章 鲤肥胖基因在巴斯德毕赤酵母中的表达

6.1 研究的目的及意义

6.2 材料与方法

6.2.1 材料

6.2.1.1 质粒与株

6.2.1.2 主要试剂

6.2.1.3 贮存液

6.2.1.4 培养基

6.2.1.5 SDS-PAGE相关溶液

6.2.1.6 Western-blot相关溶液

6.2.1.7 蛋白质银染相关溶液

6.2.1.8 本研究所用的引物

6.2.2 方法

6.2.2.1 酵母表达载体的构建

6.2.2.2 重组表达载体的线化

6.2.2.3 酵母菌感受态细胞的制备

6.2.2.4 酵母菌的转化

6.2.2.5 酵母细胞DNA的提取

6.2.2.6 酵母阳性重组子筛选

6.2.2.7 阳性转化子Mut表型鉴定

6.2.2.8 多拷贝酵母重组子的筛选

6.2.2.9 重组酵母的小量诱导表达

6.2.2.10 表达产物的SDS-PAGE电泳检测

6.2.2.11 Western-blot分析

6.3 结果与分析

6.3.1 重组质粒酶切鉴定

6.3.2 重组质粒的PCR鉴定

6.3.3 重组酵母的转化及鉴定

6.3.4 Mut表型鉴定

6.3.5 诱导产物的SDS-PAGE电泳及其Western-blot分析

6.4 讨论

6.4.1 酵母表达重组质粒的构建、表型定

6.4.2 高拷贝菌株的筛选

6.4.3 酵母的诱导表达

6.5 小结

参考文献

缩略词

附录1

附录2

致谢

发布时间: 2005-12-05

相关论文

• [1].瓦氏黄颡鱼（Pelteobagrus vachelli）脂肪代谢相关基因cDNA的克隆及表达分析[D]. 覃川杰.华东师范大学2010
• [2].瘦肉型与脂肪型猪ob基因表达差异的研究[D]. 龙火生.西北农林科技大学2003
• [3].青鱼（Mylopharyngodon pieces Richardson）和鲫（Carassius auratus）对饲料糖的利用及其代谢机制的研究[D]. 蔡春芳.华东师范大学2004
• [4].性逆转石斑鱼性腺差异表达基因的克隆鉴定及其表达研究[D]. 李尚伟.四川大学2004
• [5].花鲈和军曹鱼部分细胞因子基因的克隆及表达特征研究[D]. 邱丽华.中国科学院研究生院（海洋研究所）2005
• [6].遗传标记在鱼类育种和生态研究中的应用[D]. 王忠卫.中国科学院研究生院（水生生物研究所）2005
• [7].东亚鲤科鱼类的分子系统发育研究[D]. 王绪祯.中国科学院研究生院（水生生物研究所）2005
• [8].草鱼野生和养殖群体间遗传结构比较研究[D]. 张志伟.南京农业大学2006
• [9].鱼类MIF和SOCS基因家族的分子克隆和进化分析[D]. 金红建.浙江大学2007
• [10].几种鲆鲽鱼类Myostatin基因的克隆及结构和表达分析[D]. 钟其旺.中国海洋大学2007

标签：鱼类论文;  肥胖基因论文;  克隆与表达论文;