奶牛源性双歧杆菌和乳杆菌的分离鉴定及耐药性研究

论文摘要

为了筛选性能优良且对机体有益的耐药性双歧杆菌和乳杆菌,扩大双歧杆菌、乳杆菌的应用范围,本研究采用乳酸菌鉴别培养基和微生物厌氧培养技术从呼和浩特地区两个牧场25头乳犊牛粪便中分离到49株双歧杆菌属和乳杆菌属的细菌,并采用纸片法对分离菌进行了药物敏感性试验。结果显示:49株菌对所选12种抗菌药均有不同程度的耐性,其中,49株菌全部对甲硝唑耐药;45株菌对氨基糖苷类耐药;37株菌对喹喏酮类耐药;对四环素类、氯霉素类、红霉素类的耐药菌株分别为:10株、10株和19株。对其中7株耐药性较强的菌株进行形态、生理生化特性鉴定及16SrRNA序列分析,证明7株菌为:3株植物乳杆菌、2株链双歧杆菌、2株豚双歧杆菌。采用试管二倍稀释法及杯碟法对这7株耐药菌进一步进行试验后发现,7株菌对12种抗菌药同时具有不同程度的耐药性。其中,3株植物乳杆菌除1株菌对四环素、左氧氟沙星中度敏感外,对其它抗菌药均有耐药性;2株豚双歧杆菌中除1株菌对氯霉素中度敏感外,对其它抗菌药均有耐药性;2株链双歧杆菌除对四环素中度敏感、其中1株对氨苄西林敏感外,对其它抗菌药均有耐药性。试验菌株均对甲硝唑和氨基糖苷类抗菌药表现出较为一致的耐性。在对7株菌进行喹喏酮类耐药机制的研究时发现,采用琼脂凝胶电泳技术检测其质粒,7株菌内均未提取出质粒;采用荧光分光光度法,用2,4-二硝基酚作为抑制剂证明6株菌内存在药物主动外排系统;采用PCR技术和gyrA的QRDR序列分析表明,试验菌株有DNA旋转酶gyrA基因的突变。结论:从未使用过抗菌药的乳犊牛粪便中分离到49株双歧杆菌和乳杆菌属的菌株,这些菌株对12种抗菌药均有不同程度的耐药性,其中对甲硝唑的耐药率达到100%;对氨基糖苷类的耐药率达87.8%以上;对四环素类、氯霉素类、红霉素类的耐药率在20.4%-38.8%之间;对喹喏酮类的耐药率在70%以上。对喹喏酮类药物产生耐药与质粒介导无关,而与其存在主动外排系统以及DNA旋转酶gyrA基因突变有关。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 引言
• 1 双歧杆菌和乳杆菌分类鉴定研究进展
• 1.1 双歧杆菌和乳杆菌在乳酸菌分类体系中的位置
• 1.2 双歧杆菌和乳杆菌的形态及结构
• 1.3 双歧杆菌和乳杆菌的生长条件及生化特性
• 1.4 双歧杆菌和乳杆菌的分布特点
• 1.5 双歧杆菌和乳杆菌鉴定技术
• 1.5.1 染色和显微镜技术
• 1.5.2 分离培养技术
• 1.5.3 生理生化鉴定技术
• 1.5.4 分子生物学鉴定技术
• 2 双歧杆菌和乳杆菌的主要生理作用
• 2.1 营养作用
• 2.1.1 提高蛋白质的可消化性
• 2.1.2 提供婴幼儿神经系统发育所需的半乳糖
• 2.1.3 提高钙、磷等矿物质的利用率
• 2.1.4 维护肠内B 族维生素的稳定性
• 2.2 保健和疾病预防作用
• 2.2.1 维持肠道菌群生态平衡，抑制病原菌的生长繁殖
• 2.2.2 降低胆固醇的含量，防治心血管疾病
• 2.2.3 分解乳糖，治疗乳糖消化不耐症
• 2.2.4 激活免疫系统，抵抗感染
• 2.2.5 延缓细胞衰老，促进延年益寿
• 2.2.6 清除体内致病物质，防治肿瘤
• 3 双歧杆菌和乳杆菌制品的研究进展
• 3.1 双歧杆菌制品
• 3.1.1 以双歧杆菌活菌为主的制品
• 3.1.2 以双歧杆菌促进因子为主的保健食品
• 3.1.3 双歧杆菌和双歧因子配合的合生元制剂
• 3.2 乳杆菌制品
• 3.2.1 乳杆菌食品
• 3.2.2 乳杆菌保健品
• 4 双歧杆菌和乳杆菌的耐药性研究进展
• 4.1 耐药谱的研究进展
• 4.2 耐药方式和机理的研究进展
• 4.2.1 主动外排系统介导的耐药性研究
• 4.2.2 多重耐药转运系统介导的耐药性研究
• 4.2.3 膜通透性改变诱导的耐药性研究
• 4.2.4 酶介导的耐药性研究
• 4.2.5 靶位改变产生的耐药性研究
• 4.2.6 质粒介导的耐药性研究
• 4.3 对氟喹诺酮类抗菌药产生耐药性的研究进展
• 4.3.1 氟喹诺酮类抗菌药
• 4.3.2 拓扑异构酶基因突变介导的耐药机制
• 4.3.3 主动外排系统介导的耐药机制
• 4.4 几种耐药基因检测技术概述
• 4.4.1 荧光 PCR 检测点突变
• 4.4.2 SYBY GREEN I 结合熔解曲线分析点突变
• 4.4.3 荧光共振能量转移结合探针熔解曲线分析点突变
• 4.4.4 反向限制性位点突变分析
• 4.4.5 基因芯片技术
• 4.4.6 等位基因特异性扩增技术
• 4.4.7 PCR-ELISA 结合测序检测点突变
• 5 课题方案设计
• 6 课题研究的目的与意义
• 第二章 奶牛源性双歧杆菌和乳杆菌的分离鉴定及生物学特性研究
• 1 材料
• 1.1 样品来源
• 1.2 质控菌株
• 1.3 培养基
• 1.4 实验动物
• 1.5 试剂与药品
• 1.6 PCR 引物
• 1.7 溶液配制
• 1.8 仪器设备
• 2 方法
• 2.1 乳犊牛粪便的采集
• 2.2 试验菌株的筛选
• 2.3 双歧杆菌和植物乳杆菌试验菌株的分离纯化及保存
• 2.4 试验菌株形态、生化鉴定及特性研究
• 2.4.1 常规鉴定试验
• 2.4.2 细胞壁成份分析
• 2.4.3 乳酸和醋酸的气相色谱法色谱分析
• 2.5 试验菌株的其它生物学特性研究
• 2.5.1 试验菌株的生长特性
• 2.5.2 试验菌株耐胆盐试验
• 2.5.3 试验菌株对人工胃液和人工肠液耐受性试验
• 2.5.4 试验菌株毒性实验
• 2.6 试验菌株 PCR 鉴定
• 2.6.1 不同引物的PCR 条件
• 2.6.2 菌种制备及DNA 的提取
• 2.6.3 PCR 扩增
• 2.6.4 PCR 产物电泳检测
• 2.7 试验菌株165RRNA 序列分析
• 2.7.1 试验菌株的总DNA 的提取
• 2.7.2 试验菌株165RDNA 序列测定及序列分析
• 3 结果
• 3.1 双歧杆菌和乳杆菌的分离
• 3.2 试验菌株形态、生化及生物学特性鉴定结果
• 3.2.1 试验菌株菌体形态及菌落形态观察
• 3.2.2 试验菌株属的鉴定
• 3.2.3 试验菌株种的鉴定
• 3.3 其它生物学特性试验
• 3.3.1 生长特性研究结果
• 3.3.2 耐人工胃液和肠液的试验结果
• 3.3.3 试验菌株毒性实验结果
• 3.4 PCR 鉴定
• 3.5 16SRRNA 序列分析
• 4 讨论
• 4.1 关于试验菌株生化鉴定
• 4.2 关于试验菌株的分子生物学鉴定
• 5 小结
• 第三章 奶牛源性双歧杆菌和乳杆菌的耐药性研究
• 1 材料
• 1.1 试验菌株与对照菌株
• 1.2 试剂与抗菌药品
• 1.3 培养基
• 1.4 供试菌液的制备
• 1.5 抗菌药物原液的配制
• 1.6 仪器设备
• 1.7 数据处理
• 2 方法
• 2.1 分离菌株对12 种抗菌药的耐药性试验
• 2.2 对喹诺酮类药物耐药试验菌株的筛选
• 3 结果
• 3.1 分离菌株对12 种抗菌药的耐药性
• 3.1.1 12 种抗菌药对分离菌株的抑菌直径
• 3.1.2 分离菌株对12 种抗菌药的敏感性
• 3.1.3 分离菌株对12 种抗菌药的耐药率
• 3.1.4 不同浓度的抗菌药对试验菌株的抑菌直径
• 3.1.5 试验菌株的耐药程度
• 3.2 试验菌株对3 种氟喹诺酮类药物的耐药性
• 3.2.1 3 种喹诺酮类对试验菌株的最小抑菌浓度
• 3.2.2 3 种喹诺酮类对试验菌株的抑菌直径
• 4 讨论
• 4.1 试验菌株对12 种抗菌药的耐药性分析
• 4.2 试验菌株对3 种氟喹诺酮类药物的耐药性分析
• 5 小结
• 第四章 奶牛源性双歧杆菌和乳杆菌对氟喹诺酮类耐药机理的研究
• 1 材料
• 1.1 试验菌株与对照菌株
• 1.2 抗菌药品
• 1.3 试剂
• 1.4 溶液配制
• 1.5 主要仪器设备
• 1.6 数据处理
• 2 方法
• 2.1 试验菌株的质粒研究
• 2.1.1 试验菌株质粒的提取
• 2.1.2 试验菌株质粒的琼脂糖凝胶电泳
• 2.2 耐氟喹诺酮类试验菌株主动外排系统的测定试验
• 2.3 耐氟喹诺酮类试验菌株Ⅱ型拓扑异构酶QRDR 基因突变的测定试验
• 2.3.1 供试菌液的制备
• 2.3.2 试验菌株DNA 的提取
• 2.3.3 试验菌株DNA 旋转酶gyrA 基因QRDR 突变的测定
• 3 结果
• 3.1 质粒提取结果
• 3.2 主动外排系统证实试验结果
• 3.3 试验菌株DNA 旋转酶gyrA 基因QRDR 的测定
• 3.3.1 试验菌株DNA 旋转酶gyrA 基因片段的PCR 产物电泳结果
• 3.3.2 试验菌株gyrA 基因QRDR 的测序结果
• 3.3.3 试验菌株与相关菌株gyrA 基因QRDR 特征比较结果
• 4 讨论
• 4.1 关于试验菌株的耐药质粒
• 4.2 关于试验菌株主动外排系统确证试验
• 4.3 关于耐氟喹诺酮类药物试验菌株gyrA 基因QRDR 突变分析
• 5 小结
• 第五章 全文讨论
• 第六章 全文结论
• 主要创新之处
• 致谢
• 参考文献
• 附录
• 附录1 试验菌株对小鼠重要器官组织形态学的影响
• 附录2 牛津杯法使用的抗生素及药物敏感性标准
• 附录3 试验菌株16SRDNA 的序列
• 作者简介