TSA和5-aza-dc处理卵母细胞与5-aza-dc处理精子对牛孤雄胚发育的影响

论文摘要

在体外胚胎生产过程中,卵母细胞胞质质量好坏直接影响体外胚胎发育的命运。在体细胞核移植（SCNT）中,体细胞核在胞质内的表观程序重编程是影响体细胞核移植效率的决定性因素。研究证明,父系印迹会阻碍自然的孤雌发育。印迹基因主要通过DNA甲基化建立亲本印迹。DNA甲基化和组蛋白乙酰化对胚胎的基因表达模式产生影响。精子克隆技术是在体细胞克隆和卵母细胞细胞内单精子注射（ICSI）基础上发展起来用于体外生产孤雄胚的技术,印迹基因的正确表达也是决定精子克隆胚能否生成后代个体的决定因素。本实验室前期研究证明,精子在去核卵母细胞内能否顺利解聚是精子克隆胚生产面临的主要问题之一。在正常胚胎发育过程中,雄原核须经历一段快速的主动去甲基化过程。有研究显示,精子解聚过程有可能与雄原核的去甲基化过程相关。针对以上问题,本研究采用表观修饰药物组蛋白脱乙酰化酶抑制剂TSA（曲古抑菌素A）和DNA甲基化转移酶抑制剂5-aza-dc（5-氮-2’-脱氧胞苷）单独或联合处理卵母细胞与5-aza-dc处理精子,通过比较各种处理和抑制剂浓度的精子克隆胚发育和DNA甲基化情况,旨在分析表观遗传修饰对精子克隆胚发育的作用及其机理,探索提高精子克隆胚发育的方法。主要研究结果如下：1、TSA和5-aza-dc单独与联合处理卵母细胞对精子克隆胚发育的影响在卵母细胞成熟过程中,用浓度分别为2.5、5、10、15和20 nmol/L的TSA,浓度分别为10和20nmol/L的5-aza-dc以及TSA（5或10nmol/L）和5-aza-dc（10或20nmol/L）合并添加到卵母细胞成熟液中处理卵母细胞24h,观察各种浓度TSA和5-aza-dc单独和合并应用对卵母细胞成熟和精子克隆胚发育的影响。结果发现,适量浓度的TSA和5-aza-dc对卵母细胞的成熟均有一定的促进作用。用TSA处理卵母细胞时,随着TSA浓度的增加成熟率提高,浓度为10nmol/L的成熟率（55.5%）最高,20nmol/L时明显抑制卵母细胞成熟。用5-aza-dc组处理卵母细胞时,随着浓度的增加成熟率提高,浓度为20nmol/L的成熟率（53.8%）显著（p<0.05）高于对照组（37.8%）。用TSA与5-aza-dc联合处理卵母细胞时,所有处理组的卵母细胞成熟率均显著高于对照组（p<0.05）；当TSA浓度为10nmol/L时,随着5-aza-dc浓度增加,成熟率反而降低；当5-aza-dc浓度为20mol/L时,随着TSA浓度增加,卵母细胞成熟率增加；10nmol/L 5-aza-dc与lOnmol/L TSA合并应用时,卵母细胞成熟率最高（71.9%）。TSA处理卵母细胞后,精子克隆胚的卵裂率随着TSA浓度的增加而提高,以5nmol/L组（93.3%）最高；随着TSA浓度的增加,桑葚胚率提高,10nmol/L组桑葚胚率（41.7%）达到最高峰；10nmol/L组有着最高的囊胚率（8.3%）,与2.5nmol/L组和对照组差异显著（P<0.05）。5-aza-dc处理卵母细胞后,精子克隆胚卵裂率随着5-aza-dc浓度的增加而提高,20nmol/L时卵裂率（76.9%）最高；10nmol/L组与20nmol/L组桑葚胚率（15.4%）一样,都略低于对照组（17.1%,P>0.05）; 10nmol/L组囊胚率（7.7%）最高。TSA与5-aza-dc联合处理卵母细胞对精子克隆胚发育的影响上,TSA浓度为10nmol/L时,随着5-aza-dc浓度的增加其卵裂率、桑葚胚率与囊胚率均降低；5-aza-dc浓度为20nmol/L时,其卵裂率和桑葚胚率也随着TSA浓度的增加而降低；在10nmol/L 5-aza-dc+10nM TSA处理组有着最高的卵裂率（72.7%）、桑葚胚率（27.3%）和囊胚率（9.1%）。总体来看,TSA处理组拥有较高的卵裂率、桑葚胚率；但10nmol/L 5-aza-dc+10nmol/L TSA处理组有着最高的囊胚率。通过对处理后成熟卵母细胞DNA甲基化免疫荧光染色实验得出,5-aza-dc能够有效降低成熟卵母细胞的DNA甲基化水平,荧光强度与对照组相比降低明显；而TSA对卵母细胞DNA甲基化水平几乎没有影响。2、5-aza-dc处理精子对其衍生的精子克隆胚发育的影响在冻精复苏过程中用添加0、20、50或100nmol/L的5-aza-dc的精子洗涤液对精子处理2h,观察5-aza-dc处理对精子基因组甲基化水平和精子克隆胚发育的影响。对精子进行DNA甲基化荧光染色结果表明,5-aza-dc可以降低精子的整体DNA甲基化水平,50nmol/L降低效果最明显,100nmol/L因处理过程中细胞毒性过大,精子过早死去,降低甲基化效果反而不明显。用处理后精子生产精子克隆胚发现,20、50和100 nmol/L处理组其孤雄胚卵裂率均较对照组（58.5%）要高,但只有20 nmol/L处理组卵裂率（80.0%）较对照组差异显著（p<0.05）。5-aza-dc浓度为50nmol/L时,促进精子克隆胚发育的效果最明显,囊胚率（7.1%）和桑葚胚率（71.4%）最高。通过对发育效果较好的20和50nmol/L处理组的精子克隆胚进行DNA甲基化免疫荧光染色检测发现,20nmol/L处理组2、4细胞阶段几乎没有DNA甲基化,纵向比较其2、4、8、16细胞和桑葚胚阶段孤雄胚发现DNA甲基化水平有逐渐增强的趋势,但并不明显。50nmol/L处理组4和8细胞的精子克隆其DNA甲基化水平显著高于同时期胚胎20nmol/L组。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略词表
• 前言
• 第一章 文献综述
• 1 哺乳动物卵母细胞体外成熟的研究进展
• 1.1 哺乳动物卵母细胞体外成熟历史简要回顾
• 1.2 卵母细胞体外成熟的意义
• 1.3 卵母细胞的成熟
• 1.3.1 卵母细胞的核成熟
• 1.3.2 卵母细胞的胞质成熟
• 1.4 卵母细胞成熟过程中的表观修饰
• 1.4.1 卵母细胞成熟发育过程中的DNA甲基化变化
• 1.4.2 卵母细胞成熟发育过程中的组蛋白乙酰化变化
• 1.4.3 卵母细胞成熟发育过程中印迹的重建
• 1.5 影响哺乳动物卵母细胞体外成熟的几个因素
• 1.5.1 成熟时间
• 1.5.2 抗生素和油层覆盖
• 1.5.3 温度和湿度
• 1.5.4 气相
• 1.5.5 卵母细胞自身质量
• 2 卵母细胞胞质对后续胚胎发育的影响
• 2.1 早期胚胎发育过程中胞质内mRNA变化情况
• 2.2 胞质含量对胚胎发育影响
• 2.3 胞质质量对胚胎发育的影响
• 3 精子DNA甲基化水平对胚胎发育的影响
• 3.1 早期胚胎中精子DNA甲基化模式的维持
• 3.2 表观修饰药物对精子DNA甲基化及胚胎发育的应用
• 4 小结
• 第二章 TSA和5-aza-dc单独或联合处理卵母细胞对精子克隆胚发育的影响
• 1 实验材料
• 1.1 主要仪器设备
• 1.2 实验用主要耗材
• 1.3 主要试剂和药品
• 1.4 实验操作液
• 1.4.1 捡卵液
• 1.4.2 体外成熟液
• 1.4.3 卵母细胞操作液
• 1.4.4 精子洗涤液
• 1.4.5 胚胎培养液SOF
• 1.4.6 激活剂
• 1.5 显微操作针的制备
• 1.5.1 去核/注精针的制备
• 1.5.2 固定针的制备
• 2 实验方法
• 2.1 试验设计
• 2.2 采取卵巢
• 2.3 收集卵母细胞
• 2.4 卵母细胞体外成熟
• 2.5 显微操作卵母细胞的准备
• 2.6 注射用精子的准备
• 2.7 卵母细胞的显微去核
• 2.8 精子克隆胚的构建
• 2.9 精子克隆胚的激活
• 2.10 胚胎共培养
• 2.11 成熟后卵母细胞DNA甲基化免疫荧光染色检测
• 3 数据统计
• 4 结果与分析
• 4.1 TSA和5-aza-dc单独或联合处理卵母细胞对其成熟率的影响
• 4.2 TSA和5-aza-dc单独或联合处理卵母细胞对精子克隆胚发育的影响
• 4.3 处理后成熟卵母细胞的DNA甲基化
• 5 讨论
• 5.1 TSA和5-aza-dc对卵母细胞成熟率的影响
• 5.2 TSA和5-aza-dc处理卵母细胞对精子克隆胚发育的影响
• 5.3 小结
• 第三章 用5-aza-dc处理精子细胞对精子克隆胚发育的影响
• 1 实验材料
• 1.1 主要仪器设备和耗材
• 1.2 主要试剂和药品
• 1.3 实验操作液
• 2 实验方法
• 2.1 试验设计
• 2.2 卵巢及卵母细胞收集
• 2.3 卵母细胞体外成熟
• 2.4 注射用精子的准备
• 2.5 卵母细胞的准备,胚胎构建及后续胚胎培养
• 2.6 精子DNA甲基化免疫荧光染色检测
• 2.7 精子克隆胚DNA甲基化免疫荧光染色检测
• 3 数据统计
• 4 结果与分析
• 4.1 处理后精子DNA甲基化水平变化及其与5-aza-dc浓度的关系
• 4.2 处理精子对精子克隆胚发育的影响及其与5-aza-dc浓度的关系
• 4.3 处理对精子克隆胚DNA甲基化水平的影响及其与5-aza-dc浓度的关系
• 5 讨论
• 5.1 5-aza-dc对于冻精中精细胞DNA甲基化水平的影响
• 5.2 5-aza-dc处理冻精中精细胞对其衍生的精子克隆胚发育的影响
• 5.3 小结
• 参考文献
• 附表
• 附图
• 致谢