环境氧化应激诱发蛋白质（多肽）氧化损伤评价新方法的研究

论文摘要

环境问题是当前最重要的全球性问题之一。环境中的各种污染物对生态环境造成破坏的同时,也严重威胁着人类的健康与生存。外源性环境污染物可以通过呼吸道吸入、由食物链经消化道摄入和皮肤接触等渠道进入生物体内,诱发机体发生环境氧化应激（氧化活性物质（ROS）的过量表达）,造成DNA/RNA、蛋白质、多肽、脂类等生物分子的氧化损伤、现已证明环境氧化应激与诸多疾病有关,并且是引起疾病第二位的原因。因此,研究环境污染物诱发机体功能生物大分子的氧化损伤机理,建立其快速、灵敏评价方法有助于人们了解环境污染物的致病机理和全面评价污染物毒性,为相关疾病的早期诊断、预防和治疗提供科学依据。蛋白质是生物体各种功能的直接执行者。当其暴露于氧化应激的环境中时,ROS能够诱发机体蛋白质分子结构的氧化性损伤和功能的消弱／丧失,进而导致诸多疾病的发生。因此,研究环境污染物对蛋白质的氧化损伤作用一直是环境污染与健康领域的热门课题。本论文以分析化学、环境毒理学为背景,结合电化学、高效液相色谱、质谱等实验技术模拟研究了环境氧化应激诱发氨基酸、多肽、蛋白质的氧化损伤机理,并对氧化损伤的评价方法进行了探讨。论文主要包括以下四部分：论文第一章阐述了各类污染物诱发环境氧化应激的途径；归纳了环境氧化应激致氨基酸、多肽、蛋白质生物分子损伤的类型以及蛋白质氧化损伤与相关疾病的相关关系；介绍了蛋白质氧化损伤的分析与评价技术,蛋白质氧化损伤研究进展。在文献综述的基础上分析了目前研究中存在的问题,提出了基于电化学循环伏安、液相色谱-质谱联用技术在模拟研究环境氧化应激诱发氨基酸、多肽、蛋白质的氧化损伤机理的评价方法。论文第二章选择氨基酸、多肽、蛋白质作为电化学氧化损伤的靶分子,从分子水平上模拟研究其相应的界面氧化损伤机理,为机体蛋白质氧化损伤机理的深入研究提供了参考。1)利用电化学循环伏安技术模拟研究了胱氨酸、半胱氨酸在裸金电极上的氧化还原行为,探讨了半胱氨酸的界面氧化损伤机理。研究结果表明（以金电极表面氧化为例）,正扫过程中半胱氨酸有两个特征氧化峰,0.65V附近的氧化峰对应于半胱氨酸氧化生成胱氨酸,0.85V附近的氧化峰对应于胱氨酸、半胱氨酸氧化生成CySOxH（x=2、3）；负扫过程半胱氨酸与多晶金形成Au-S键（该过程为失电子过程）,还原峰电流明显降低且随半胱氨酸浓度增加而逐步下陷。在此基础上,研究了体系除氧、酸碱度、扫描速率、温度等因素对半胱氨酸在电极上发生电化学氧化损伤过程的影响。该结果对于全面认识氧化应激条件下含硫多肽、蛋白质在生物膜表面的氧化损伤机理及损伤修复提供了新的思路与方法。2)利用电化学循环伏安法模拟研究了还原型谷胱甘肽、氧化型谷胱甘肽在金电极上的界面氧化还原行为。相对位阻较小的半胱氨酸、胱氨酸在金电极表面氧化过程,空间位阻比较大的还原型谷胱甘肽并未发生两步的氧化过程,而是直接氧化生成GSOxH（难以生成氧化性的GSSG）。上述现象与普遍报道的GSH在环境氧化应激条件下生成GSSG的情况并不一致。这可能是由于GSH游离巯基两侧各自存在的一个氨基酸,使得巯基在电极表面的氧化过程存在明显的空间位阻作用。游离巯基之间的距离较大,无法形成二硫键（S-S）,因而只能生成GSOxH。该过程一定程度上类似于生物体线粒体膜、细胞膜等部位上发生的生物功能分子的氧化损伤过程,因而对于生物体膜上氧化损伤的研究,乃至相关疾病的研究都具有重要的意义。3)利用电化学循环伏安技术研究了牛胰岛素在裸金电极上的氧化还原行为。通过与磷酸盐缓冲液、胱氨酸和胰岛素所含的其他氨基酸的电化学特征比较,胰岛素的电化学氧化损伤机理被详细阐明：胰岛素分子中的二硫键是其潜在的损伤位点并且其氧化产物为次磺酸（RSOH）、亚磺酸（RSO2H）以及磺酸（RSO3H）类化合物,但相对胱氨酸而言,由于空间位阻作用胰岛素需要更为严苛的条件才能实现氧化；由于胰岛素分子中二硫键S-SCYS6A,CYS11A和s-sCYS20A,CYS19B具有较小的溶剂接触面积而难以氧化。因此,该研究条件下胰岛素的主要氧化位点应为二硫键s-sCys7A-Cys7B。论文的第三章选择多肽、蛋白质氧化损伤生成的羟基、亚砜产物作为准确表述蛋白质（多肽）氧化损伤位点、损伤程度的生物标记物,并利用液相色谱—质谱联用技术及质谱碎片技术（LC-MS、LC-MS/MS）作为主要检测技术,建立其定性、定量研究的新方法。1)利用液相色谱-质谱（LC-MS）、二级质谱（MS/MS）等技术研究了UV/H2O诱发多肽氧化损伤位点、损伤程度及损伤机理,并探讨了以多肽氧化损伤位点作为氧化损伤标志物的可行性。研究证实UV/H2O（模拟环境氧化应激条件）对目标多肽中的FMRF存在明显的氧化损伤且损伤程度与时间正相关,并且LC-MS技术能够实现损伤产物与未损伤多肽的快速分离和准确鉴定。因此,以多肽氧化损伤产物作为直接评价氧化损伤的新型标记物具有潜在优势。本研究不仅拓展了多肽和蛋白质氧化损伤生物标记物的范围,也为阐明多肽等功能分子氧化损伤位点、相应位点的氧化损伤程度以及氧化损伤机理的研究提了供一种准确高效评价的新方法。2)利用高效液相色谱和串联质谱技术建立了以靶蛋白细胞色素C氧化损伤位点和损伤程度作为氧化损伤标志物评价其氧化损伤机理的新策略。液相色谱-质谱联用（LC/MS）和多肽指纹图谱鉴定（MS/MS）技术分别被用于胰蛋白酶解多肽的分离检测和UV/H2O氧化损伤位点的定位研究。结合LC/MS和MS/MS实验结果,可以确定酶解多肽C14AQC（heme）HTVEKK22、C11AQCHTVEK22、E60ETLMEYLENPKK73、M80IFAGIK86、M80IFAGIKK87中的Cys14、Cy17、Met65、Met80残基是主要的氧化损伤位点。上述位点氧化损伤程度与氧化时间的正相关性证实以蛋白质氧化损伤产物作为评价其氧化损伤机理的可行性。3)利用60Co-γ射线辐照牛血红细胞方式,模拟了环境氧化应激条件下过量表达的ROS对牛血红蛋白的氧化损伤作用,通过高效液相色谱和串联质谱技术建立了胞内血红蛋白氧化损伤位点和损伤程度的评价方法。通过比较损伤前后血红蛋白酶解的总离子色谱图及相应组分的MS/MS数据,发现靶分子的氧化损伤位点主要是部分暴露的氨基酸残基（例如α-Phe36、β-Met、β-Trp14）。氧化产物的定量分析表明,各损伤位点的氧化程度与氧化剂量正相关且受到氨基酸残基类型和暴露程度控制。与传统的蛋白羰基标记方法相比,本文所采用的方法为体外模拟条件下以及“体内”氧化应激实际存在时蛋白氧化损伤评价提供有效的技术支持。论文的第四章最后对本论文的各研究部分进行了总结,并分析了蛋白、多肽等靶分子氧化损伤评价方法的优势与不足之处,展望了该领域的发展方向。本研究丰富了环境污染物诱发蛋白、多肽等生物功能分子氧化损伤的评价方法,有助于人们从分子水平了解环境污染物的致病机理和全面评价污染物毒性,为相关疾病的早期诊断、预防和治疗提供了科学依据。

论文目录

• 目录
• CONTENT
• 摘要
• ABSTRACT
• 符号说明
• 第一章绪论
• 第一节 环境氧化应激与诱发因素
• 1 环境氧化应激
• 2 环境氧化应激的诱发因素
• 第二节 环境氧化应激、蛋白质损伤与疾病
• 1 氧化应激的重要靶分子---蛋白质
• 2 蛋白质氧化损伤类型
• 3 蛋白氧化损伤诱发的相关疾病
• 第三节 环境氧化应激致蛋白质氧化损伤研究的分析评价技术
• 1 蛋白质氧化损伤样品的分离技术
• 2 蛋白质氧化损伤的检测技术
• 3 蛋白质氧化损伤产物作为环境氧化应激标记物的研究
• 4 环境氧化应激致蛋白质氧化损伤的模拟评价研究
• 第四节 论文的研究目的、研究内容和研究意义
• 1 论文的研究目的
• 2 论文的主要研究内容
• 3 论文的研究意义
• 第二章 基于电化学技术的蛋白质（多肽）界面氧化损伤研究
• 第一节 半胱氨酸界面氧化损伤过程的电化学模拟研究
• 1 前言
• 2 实验部分
• 2.1 实验仪器
• 2.2 试剂
• 2.3 工作电极的预处理
• 2.4 缓冲溶液选择
• 2.5 试验方法
• 3 结果与讨论
• 3.1 研究体系的循环伏安特征
• 3.2 电化学循环伏安条件对靶分子氧化还原过程的影响
• 4 结论
• 第二节 谷胱甘肽界面氧化损伤过程的电化学模拟研究
• 1 前言
• 2 实验部分
• 2.1 实验仪器
• 2.2 试剂
• 2.3 工作电极的预处理
• 2.4 试验方法
• 3 结果与讨论
• 3.1 研究体系的循环伏安特征
• 3.2 靶分子氧化损伤位点与损伤机理分析
• 3.3 电化学循环伏安条件对靶分子氧化还原过程的影响
• 4 结论
• 第三节 胰岛素蛋白界面氧化损伤过程的电化学模拟研究
• 1 前言
• 2 实验部分
• 2.1 实验仪器
• 2.2 试剂
• 2.3 工作电极的预处理
• 2.4 试验方法
• 3 实验结果与讨论
• 3.1 研究体系的循环伏安特征
• 3.2 靶分子氧化损伤位点分析
• 3.3 电化学循环伏安条件对胰岛素靶分子氧化还原过程的影响
• 4 结论
• 第三章 基于色谱、质谱技术蛋白质氧化损伤新型标记物的研究
• 第一节 以多肽氧化产物作为评价多肽、蛋白氧化损伤效应生物标志物的可行性研究
• 1 前言
• 2 实验部分
• 2.1 实验仪器
• 2.2 试剂与材料
• 2.3 实验方法
• 3 实验结果与讨论
• 3.1 氧化损伤标记物的液相色谱分离与质谱检测
• 3.2 氧化损伤产物的二级质谱分析---氧化损伤位点定位
• 3.3 多肽氧化损伤的剂量效应关系---标记物有效性的评价
• 4 结论
• 第二节 环境氧化应激条件下细胞色素C氧化损伤位点和损伤程度评价的新型标记物研究
• 1 前言
• 2 实验部分
• 2.1 实验仪器
• 2.2 试剂与耗材
• 2.3 实验方法
• 3 结果与讨论
• 3.1 细胞色素C酶解产物的LC/MS分析---氧化损伤潜在标记物（氧化多肽）的分离鉴定
• 3.2 氧化多肽的MS/MS分析---氧化损伤位点的鉴定
• 3.3 蛋白靶分子氧化损伤程度的定量化——标记物的有效性评价
• 4 结论
• 第三节 环境氧化应激条件下牛血红蛋白氧化损伤位点和损伤程度的新型标记物---细胞水平蛋白质氧化损伤模拟研究
• 1 前言
• 2 实验部分
• 2.1 试剂
• 2.2 仪器
• 2.3 实验方法
• 3 结果与讨论
• 3.1 血红蛋白酶解产物的LC/MS分析---氧化损伤候选标记物的鉴定
• 3.2 多肽氧化损伤前后MS/MS差异化分析---氧化损伤位点的鉴定
• 3.3 氧化多肽的选择性离子分析-新型标记物的准确定量研究
• 3.4 蛋白损伤位点氧化损伤趋势的比较分析---标记物的有效性评价
• 4 结论
• 第四章 主要结论和研究展望
• 1 主要结论
• 2 研究展望
• 参考文献
• 致谢
• 攻读博士学位期间的科研情况
• 学位论文评阅及答辩情况表
• 英文论文