论文摘要
新城疫（Newcastle.disease. ND）是自新城疫病毒（Newcastle.disease. NDV）引起的种对世界范围内养离业造成E大危害的急性传染病。NDV在病毒学上的完整分类地位是单股负RNA病毒目（Mononegavirales）、目黏病毒科（Paiamyxovirdae）.副黏病毒亚科（Paiamyxovirdae）、离腮腺炎病毒属（Avulavirus）。NDV为不分节段的单股负链RNA病毒，基因组结构模式为3-NP-P-M-F-H-L-5，共编码核衣壳蛋自（NP）、磷蛋自（P）、基质蛋自（M）、融合蛋自（F）、血凝素神经酸酶酶蛋自（HN）及大聚合酶蛋自（L）等6种结构蛋自，以及自于P基因的RNA编辑现象产生的v和w!种非结构蛋自，基因组两端为重要的调控序列。ND自1926年被发现以来，至20世纪末，在世界范围内已经发生了4次大流行。目前，学术界般根据病毒F基因部分序列特征将NDv分为9个不同的基因型，部分基因型还有不同的亚型。ND的每次大流行都与NDv新基因型的出现有关，其中基因Ⅶ型毒株是10世纪90年代中期以来我国NDv流行毒株的优势基因型，也是当前造成我国和世界上鸡群和鹅群ND大面积流行的王要基因型。自于目前普遍使用的新城疫商品化疫苗株与当前我国新城疫流行毒株基因型的不同所导致的免疫偏差现象，我国新城疫的防制直是防而不止，且有愈演愈烈z势，尤其是近年来频王要疫病之一。目前针对该病防治的研宄热点在于尽快开发同源同型的鹅源目黏病毒弱毒疫苗。反向遗传操作技术是目前分子病毒学领域广泛用于生物E学研究、病毒基因组结构与功能体系早在1999年就经建互起来了之一.而国内的研究起步较晚，研宄相对滞后。本研究以本室于1999年在吉林省长春市农安县爆发的疫情中分离到的一株鹅源新城疫病毒强毒株NA-1株（基因VIId型）为主要研究对象,前期先后完成了鹅源新城疫强毒株NA-1株的全基因组测序分析及分段克隆、主要基因的克隆表达、辅助表达质粒和微型基因组的构建等工作,随后笔者构建了鹅源新城疫强毒株NA-1株的全长cDNA感染性克隆并成功拯救出了具有血凝活性的野生型病毒rNA-1株,其生物学特性与亲本病毒NA-1株相近。在此基础上,根据鹅源新城疫病毒NA-1株F蛋白与鸡源新城疫标准弱毒疫苗株LaSota株F蛋白的裂解位点区氨基酸序列的不同,笔者设计了两对特异性引物并利用Overlap PCR方法对所构建的全长cDNA感染性分子克隆进行定点突变,使全长cDNA感染性分子克隆F基因第112位氨基酸密码子由AGG（精氨酸, Arg, R）突变为GGG（甘氨酸, Gly, G）,115位氨基酸密码子由AAA（赖氨酸, Lys, K）突变为GAA（谷氨酸, Glu, E）,第117位氨基酸密码子由UUU（苯丙氨酸, Phe, F）突变为CUU（亮氨酸, Leu, L）,从而构建成功了具有典型弱毒株特征的F基因的人工突变克隆。随后将克隆的F’基因替换到鹅源新城疫病毒NA-1株的全长克隆FL-cDNA质粒上,构建成功了鹅源新城疫病毒NA-1株的突变克隆FL-cDNA-F’并再次进行病毒的“拯救”,最终得到了一株毒力较弱的、可用于水禽新城疫防治的鹅源新城疫病毒疫苗候选株。本研究成功救获的人工突变的鹅源新城疫病毒rNA-1-F’株MDT为96 h, ELD50为10-4.5/0.2 mL,与人工突变前的亲本毒株NA-1株(MDT=59.6 h,ELD50=10-7/0.1 mL)相比毒力已明显减弱,进一步证明了F蛋白裂解位点的氨基酸序列与NDV毒力的密切关系。本室将随后对该救获毒株进行免疫原性以及遗传稳定性等相关研究,为今后鹅副黏病毒病弱毒疫苗的生产化、商品化奠定良好基础,为我国当前鹅副黏病毒病的综合防治提供技术支撑。
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