在镉盐和甲基对硫磷的胁迫下牙鲆肝脏和脑组织差异蛋白质组的研究

论文摘要

水体污染常见的分析检测技术有两大类,即理化监测和生物监测,前者反映瞬时、局部的污染状况,而后者能客观地反映污染源对生物体的危害程度。本论文选用牙鲆（Paralichthys olivaceus）为实验材料,以差异蛋白组学为主要分离与分析手段,筛选与鉴定出由金属镉（Cadmium,Cd）胁迫下的牙鮃肝脏差异蛋白质和由有机磷农药甲基对硫磷（Methyl parathion,MP）胁迫下的牙鲆脑组织差异蛋白质。利用电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）技术分析在镉胁迫下（96h）,牙鲆各组织器官中金属镉含量,发现镉在肝脏中具有较高的富集现象,其浓度递增近6倍。推测金属镉可能诱导肝细胞表达蛋白指示物的种类最多,变化趋势最为明显,并适合选用蛋白质组学技术研究在金属镉胁迫下,牙鲆肝组织表达的差异蛋白质,并从中筛选出可用于监测重金属镉污染程度及危害性的蛋白指示物。采用差速离心分离技术,对牙鲆肝组织全蛋白进行粗分离,它能有效地提取肝组织中的低丰度蛋白质,提高了筛选蛋白质指示物的种类和检测灵敏度。双向聚丙烯酰胺凝胶电泳（2D-PAGE）图谱显示,选用差速离心分离技术提取的牙鲆肝组织全蛋白的斑点数高达1900个,并具有较高的分辨率和灵敏度,适合于开展肝脏蛋白质组学的研究。选用蛋白质组学软件比对分析,发现重金属镉胁迫下,牙鲆肝组织表达差异蛋白质约51个,经肽质量指纹图谱（PMF）和数据库比对技术初步鉴定出热休克蛋白、过氧化氢酶等与镉盐毒性有关的蛋白质。预测这些差异蛋白质可作为监测与评价镉盐污染程度及危害性的指示蛋白质,并适合于开展镉盐毒理学机理与途径的研究。常见的检测有机磷农药污染程度的方法有残留量检测和生物酶活性变化的分析。本文有目的地选择斑马鱼（Danio rerio）（经典生物模型）为模拟实验材料,采用气质联用（GC-MS）技术研究斑马鱼受甲基对硫磷胁迫前后,体内各器官的残留量和变化趋势;进一步分析超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和乙酰胆碱酯酶（AchE）的酶活性的变化趋势,结果发现,甲基对硫磷在斑马鱼肝组织中富集,而AchE活性则始终受到明显抑制,其研究目的为在牙鲆中筛选与鉴定具有监测甲基对硫磷污染程度及危害性的蛋白指示物奠定可行基础。在甲基对硫磷胁迫下,研究牙鲆肝脏内甲基对硫磷残留情况和脑组织内AchE酶活性的变化,其结果与斑马鱼实验模型中所获得结果较为相似。差异蛋白质组技术分析胁迫前后牙鲆脑组织蛋白,共表达17个差异蛋白质,初步鉴定出热休克蛋白、谷胱甘肽S-转移酶等蛋白。推测这些差异蛋白质不仅适合于作为监测与评价甲基对硫磷污染程度及危害性的指示蛋白质,而且适合于开展甲基对硫磷毒理学机理与途径的研究,具有重要的科学意义和潜在的应用价值。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 第一章 前言
• 第一节 水体污染及危害性概述
• 1.1 重金属和有机磷农药概述
• 1.2 重金属和有机磷农药的生物毒性
• 1.3 镉和甲基对硫磷的生物毒性
• 第二节 重金属和有机磷农药水体污染监测与生物标志物
• 2.1 酶标志物
• 2.2 应激蛋白类
• 2.3 细胞内小分子抗氧化物质
• 2.4 细胞与核酸标志物
• 2.5 铁蛋白捕获重金属离子与有机小分子
• 第三节 蛋白质组学及其研究进展
• 3.1 蛋白质组学主要分析技术的研究进展
• 3.2 其他蛋白质组学概念和新技术
• 3.3 蛋白质组学在环境污染监测中的应用
• 第四节 本论文主要研究内容和意义
• 第二章 材料与方法
• 第一节 实验材料
• 1.1 生物材料
• 1.2 常用试剂
• 1.3 仪器设备
• 1.4 实验用试剂配制
• 第二节 实验方法
• 2.1 样品制备
• 2.2 Bradford法测定蛋白含量
• 2.3 ICP-MS测定样品镉含量
• 2.4 GC-MS测定样品甲基对硫磷含量
• 2.5 各种酶活力的测定方法
• 2.6 第一向等电聚焦电泳
• 2.7 平衡及第二向SDS-PAGE电泳
• 2.8 硝酸银染色
• 2.9 蛋白质的肽质量指纹鉴定
• 第三章 结果与讨论
• 第一节 镉盐胁迫牙鲆的实验结果
• 1.1 牙鲆各组织器官中镉的分布
• 1.2 优化牙鲆肝脏蛋白质组的提取方法
• 1.3 镉盐胁迫下牙鲆肝脏组织的差异蛋白质组
• 1.4 讨论
• 第二节 斑马鱼的模拟实验
• 2.1 斑马鱼各组织器官中甲基对硫磷的分布
• 2.2 甲基对硫磷对斑马鱼体内各种酶活性的影响
• 2.3 讨论
• 第三节 甲基对硫磷胁迫牙鲆试验的结果
• 3.1 甲基对硫磷在牙鲆肝脏中的残留情况
• 3.2 甲基对硫磷对牙鲆脑内AchE活性的影响
• 3.3 甲基对硫磷胁迫下牙鲆脑组织的差异蛋白质组
• 3.4 讨论
• 第四章 小结
• 附录:牙鲆肝、脑差异蛋白的部分PMF图谱
• 缩略语表
• 参考文献
• 致谢