利用cDNA-AFLP技术分离玉米耐低磷相关基因的研究

论文摘要

为了研究玉米在低磷条件下所形成的分子机理和反应机制。本实验通过cDNA-AFLP技术分离耐低磷的相关基因以及对在低磷条件下和正常磷条件下的相关基因的差异表达片段进行筛选、分离和生物信息学分析。结果如下：1.建立了适合提取玉米根和叶的总RNA的体系，并反转录成双链cDNA，完整性较好。2.运用cDNA-AFLP双酶切技术,获得120条差异表达片段，然后进行测序得到78条测序结果。3．利用生物信息学对测序结果分析和功能预测，其中有8个既没有注释也没有蛋白功能分析，而其余70个都有蛋白功能，主要包括未知或未进行分类蛋白，与蛋白合成相关的蛋白，细胞营救／毒性／防御蛋白，次生代谢相关蛋白，能量代谢蛋白，代谢相关蛋白，转录／细胞交流信号转导相关蛋白，细胞运输／周期蛋白等九大类。4.利用9个与磷胁迫直接相关的基因片段对玉米cDNA文库进行分析,获得9个玉米相关基因的全长cDNA序列,与其它植物同源性分析表明有6个与拟南芥和水稻等其他植物磷代谢相关基因同源性很高，而其余3个与其他物种同源性很低，这为进一步克隆和验证玉米这些磷代谢相关基因奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 文献综述
• 1.1 植物磷营养研究背景
• 1.1.1 磷素在植物体内的重要作用
• 1.1.2 土壤中磷资源现状
• 1.1.3 植物磷营养效率的基因型差异
• 1.2 基因差异表达基因的分离方法
• 1.2.1 mRNA 差异显示
• 1.2.2 cDNA 代表性差异分析
• 1.2.3 抑制性消减杂交
• 1.2.4 基因表达系列分析法
• 1.2.5 RFLP 差异显示技术
• 1.2.6 cDNA 微阵列
• 1.2.7 cDNA 扩增片段长度多态性
• 1.3 cDNA-AFLP 技术研究进展
• 1.3.1 cDNA - AFLP 的基本原理
• 1.3.2 cDNA - AFLP 技术的特点
• 1.3.2.1 cDNA - AFLP 技术内切酶与引物的选择
• 1.3.2.2 假阳性比较低，重复性好
• 1.3.2.3 可准确地反映基因间表达量的差异
• 1.3.3 cDNA - AFLP 技术的应用
• 2 引言
• 2.1 研究内容
• 2.2 研究目的
• 2.3 研究意义
• 2.4 技术路线
• 3 材料与方法
• 3.1 试验材料
• 3.2 仪器设备和化学试剂
• 3.2.1 仪器设备
• 3.2.2 化学试剂
• 3.3 实验方法
• 3.3.1 低磷胁迫的处理
• 3.3.2 总 RNA 的提取和检测
• 3.3.3 双酶切 cDNA- AFLP 分析
• 3.3.3.1 引物和接头的合成
• 3.3.3.2 cDNA 的合成
• 3.3.3.3 cDNA 双酶切和连接
• 3.3.3.4 cDNA 酶切片段的预扩增
• 3.3.3.5 预扩产物的选择扩增
• 3.3.4 聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 3.3.4.1 胶板制备
• 3.3.4.2 预电泳
• 3.3.4.3 电泳
• 3.3.4.4 银染
• 3.3.5 差异片段的回收、克隆和鉴定
• 3.3.5.1 特异片段的回收
• 3.3.5.2 二次扩增差异条带、回收及纯化
• 3.3.5.3 纯化产物与 T-Vector 的连接与转化
• 3.3.5.4 重组子的鉴定
• 3.3.6 阳性克隆的保存与测序
• 3.4 生物信息学分析
• 4 结果与分析
• 4.0 正常磷和低磷条件下玉米幼叶比较
• 4.1 玉米幼叶总 RNA 的提取
• 4.2 双链 cDNA 的合成
• 4.3 双链 cDNA 的双酶切
• 4.4 cDNA 酶切片段的预扩增
• 4.5 预扩产物的选择扩增
• 4.6 回收片段的二次 P CR
• 4.7 差异片段的测序结果
• 4.8 测序片段的功能预测
• 4.9 同源性分析
• 5 讨论
• 5.1 实验材料的选择
• 5.2 关于磷胁迫下多种代谢途径的分析
• 5.3 分离片段代表的生物学意义
• 6 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 作者简介