论文摘要
缺血性脑血管病的发病率正逐年增高，这种疾病对人类健康乃至生命的威胁使其愈来愈受到关注。急性脑缺血后，因缺血灶神经细胞死亡而导致的神经功能缺损至今尚缺乏真正有效的治疗措施和药物，因此如何促进脑缺血患者受损神经功能的修复仍是目前研究的重点。九十年代初神经干细胞（NSCs）的发现，打破了神经元不能再生的传统观念，为中枢神经系统的损伤修复注入了新的活力。NSCs的发现提示脑组织自身修复功能的存在，脑损伤后内源性神经干细胞的激活有助于受损神经功能的恢复，但其新生的神经细胞数量有限，使受损细胞不能为足够的新生细胞所替代，这种修复有其限制性。另外，外源性NSCs移植也可用于修复受损的神经功能，但由于神经干细胞取材、培养困难，而且有免疫排斥、来源受限、伦理道德的约束限制了其进一步应用。而骨髓来源的间充质基质细胞（Bone Marrow-derived Mesenchymal Stromal Cells，MSCs）具有取材、培养方便，可取自体骨髓进行自体移植，并有多种分化潜能等优点，因此MSCs如果在脑内能够大量分化成功能性神经细胞，将是治疗中枢神经系统损伤修复的较为理想的细胞。本实验通过成年大鼠局灶性脑缺血发生后静脉注射移植间充质基质细胞（MSCs）初步阐明MSCs在大鼠脑内增殖、迁移和分化的具体过程及其修复受损神经功能的效果、机制，从而能为MSCs移植治疗局灶性脑缺血疾病提供理论及实验依据。方法：1．从2月龄Sprague-Dawley大鼠的长骨中取出骨髓细胞置于培养瓶中培养，利用MSCs的贴壁生长特性，通过换液弃除悬浮生长的血细胞，将MSCs分离出来进行体外培养、扩增及纯化。因为贴壁细胞可能同时混有淋巴细胞、单核细胞，故在细胞传代时控制胰蛋白酶的消化时间在2-3min，在该时间段内绝大部分MSCs可以从培养瓶上脱落，而淋巴细胞、单核细胞贴附性强仍贴附在培养瓶底。从而使MSCs得以进一步纯化。流式细胞术检测MSCs表面CD90/CD45表达情况来鉴定第三代MSCs，并通过体外诱导分化为脂肪细胞进一步鉴定。取第3-4代MSCs用于实验。2．健康雄性SD大鼠，随机分为MCAO移植组、MCAO对照组。每组20只。采用线栓法制备大鼠局灶性脑缺血模型，以大鼠神经功能障碍的出现作为脑缺血的整体评价，采用HE和TTC染色判断脑缺血的部位及范围。模型成功后第5d，MCAO移植组大鼠经股静脉注射总体积1ml的MSCs单细胞悬液（含4×106个MSCs），对照组以1ml无血清培养液取代，然后进行下列处理：①根据神经缺损评分标准，于大鼠MCAO术前，术后1、7、14、21d分别进行神经缺损评分；②MCAO术后21d各组大鼠随机取5只做大脑TTC染色和梗死面积计算；③各组大鼠按MCAO术后不同的饲养时间分别于第7d、14d、21d三个时间点随机取5只处死。在第6d、13d、20d三个时间点大鼠腹腔注射5-嗅尿嘧啶（BrdU）以标记增殖细胞，在最后一次注射后1d随机取5只处死，灌注取脑，多聚甲醛固定，石蜡包埋，制作石蜡切片。选用5-嗅尿嘧啶（BrdU）、神经元特异性烯醇化酶（NSE）和胶质纤维酸性蛋白（GFAP）作为增殖、分化的标记物。免疫组织化学染色方法检测BrdU阳性细胞、BrdU和NSE双阳性细胞以及BrdU和GFAP双阳性细胞。依据以上检测结果分析脑缺血后两组大鼠内源性神经干细胞激活情况，MSCs在脑内增殖、迁移和分化情况，以及两组大鼠受损神经功能修复的效果和机制。结果：1．通过换液、传代，MSCs得到了纯化。用抗CD45/CD90抗体通过流式细胞仪检测第三代MSCs，发现细胞表面标志CD90表达阳性的细胞已占到93％，细胞表面标志CD45表达阳性的细胞为1.7％，说明培养的细胞为MSCs且纯度已达93％以上。而且向脂肪细胞诱导分化实验中显示，诱导14d时的细胞用脂肪特异性结合的染料油红-O染色，结果大部分细胞的胞质中的脂滴都被染为红色，结果表明，该细胞在体外还可以向脂肪细胞分化。因此进一步证实本实验培养的细胞确为间充质基质细胞，排除造血干细胞的可能性。2．应用线栓法闭塞大鼠左侧大脑中动脉后，大鼠出现以右上肢为重的右侧偏身瘫痪同时伴有左侧Hornor氏征。TTC和HE染色均显示缺血区域位于左侧纹状体、颞顶区皮层，位置和范围较为稳定。3．大鼠MCAO后21d，MSCs移植组与对照组相比梗死体积差异无显著性。局灶性脑缺血再灌注后14、21d，MSCs移植组神经缺损评分明显低于对照组（P值小于0.05）。4．在同一时间点检测到侧脑室SVZ处、缺血灶及周边脑区BrdU标记阳性细胞、BrdU+GFAP和BrdU+NSE双标阳性细胞的数量，都是移植组明显多于对照组。经静脉注射移植的MSCs主要迁移到了缺血灶及周边脑区、存活并增殖，部分MSCs可以分化为神经元样和星形胶质细胞样细胞，这些细胞主要分布于缺血区域的周围。5．MSCs组梗死区周围GFAP阳性细胞与对照组在MCAO后14、21d这两时间点比较都明显减少。结论：1．本实验用直接贴壁分离法从SD大鼠长骨中分离出间充质基质细胞并在体外培养成功，获得具有增殖分化能力的纯化的间充质基质细胞。2．大鼠线栓法MCAO模型是研究局灶性脑缺血后自身修复和内源性神经干细胞激活理想的动物模型。脑缺血后大鼠侧脑室SVZ内源性神经干细胞增殖增加，BrdU染色证实这些细胞部分处于增殖状态，迁移至缺血灶及周边脑区，可逐渐分化为成熟的神经元和星形胶质细胞。3．脑缺血大鼠通过静脉移植MSCs后，植入的细胞在缺血灶及周边脑区增殖、迁移及分化并可能部分替代受损细胞，同时可能通过加强受体神经发生区干细胞的激活、抑制胶质瘢痕的形成、增加神经营养因子的分泌等多个途径使脑缺血大鼠受损神经功能得以改善。因此MSCs移植有助于局灶性脑缺血后受损神经功能的修复。
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标签：间充质基质细胞论文; 移植论文; 局灶性脑缺血模型论文; 神经干细胞论文;