本文主要研究内容
作者朱思远（2019）在《无抗黑曲霉表达系统构建及脂肪酶的表达》一文中研究指出：黑曲霉作为一种重要的工业生产菌株,已逐步开发成为一种重要的酶表达系统。在本研究中,首先选择一株低蛋白背景且潮霉素敏感菌株为表达宿主,并对农杆菌介导转化法和PEG-原生质体转化法进行条件优化,然后以脂肪酶为模式酶在黑曲霉中进行同源/异源脂肪酶的表达。通过转录和转录后水平改造提高了黑曲霉脂肪酶ANL的表达量,并进行了酶学性质研究。最后初步开展了CRISPR/cas9技术在黑曲霉表达系统中的应用,构建了尿嘧啶缺陷型菌株。主要结果如下:（1）对农杆菌介导转化和PEG-原生质体转化两种方法进行了条件优化。优化后农杆菌介导转化的条件是不萌发的新鲜孢子与OD600培养至0.9-1.0的农杆菌以1:1的比例混合后,在乙酰丁香酮浓度为200μmol·L-1的IM平板上,23oC避光培养48 h后进行转膜。最佳转化效率大约为每106个孢子获得60±5个转化子,并且阳性率保持在90%以上。原生质体制备条件为:107个?mL-1黑曲霉孢子接种PDA浸提液,30oC,200 r·min-1培养24 h,收集菌丝体,按质量体积比1:10加入裂解酶液(0.8 mol·L-1MgSO4,1%纤维素酶,0.5%蜗牛酶,0.25%溶菌酶),37oC,120 r·min-1酶解2.5 h后收集原生质体,获得原生质体个数约6.8×105个?mL-1,原生质体再生率约63±2.5%。（2）将同源及异源蛋白在黑曲霉中进行表达,异源华根霉脂肪酶RCL在黑曲霉CICC2169中未能表达,同源黑曲霉脂肪酶ANL可以表达但表达量较低。启动子转录水平分析,诱导型启动子glaA转录水平相比于野生型提高50.35倍,而组成型启动子gpdA转录水平相比于野生型提高994.86倍。尝试3种方式来提高ANL的表达水平,包括补充内含子（提高mRNA的稳定性）、添加kozak序列（增强翻译效率）、不同信号肽（增强蛋白胞外分泌效率）。在均是glaA为信号肽的前提下,改造之前初始转化子检测不到酶活力,单补充内含子的转化子酶活约为75.80 U?mL-1,单添加kozak序列的转化子酶活约为61.33 U?mL-1,信号肽的影响效果为cbhⅠsignal>ANL signal>glaA signal。整合三种策略,表达最好的转化子为kocbhS-ANL1000,最高酶活达到314.67 U?mL-1。在含有kozak序列的前提下,具有glaA、ANL、cbhⅠ信号肽的补充内含子转化子比相应的不含内含子转化子脂肪酶发酵活力分别提高了1.64倍、1.94倍、3.61倍。酶学性质研究表明ANL最适pH为3.0,最适温度为45oC。（3）将CRISPR/cas9基因编辑技术在黑曲霉中应用,将CRISPR/cas9质粒通过原生质体转化法向黑曲霉转化并筛选转化子。sgRNA靶向pyrG基因,筛选转化子获得尿嘧啶缺陷型菌株（?pyrG）,通过测序确定突变位点,确定是位于sgRNA区域内,打靶效率约25%。sgRNA靶向hyg基因,尝试通过CRISPR靶向hyg基因进行破坏,但是未获得阳性转化子。
Abstract
hei qu mei zuo wei yi chong chong yao de gong ye sheng chan jun zhu ,yi zhu bu kai fa cheng wei yi chong chong yao de mei biao da ji tong 。zai ben yan jiu zhong ,shou xian shua ze yi zhu di dan bai bei jing ju chao mei su min gan jun zhu wei biao da su zhu ,bing dui nong gan jun jie dao zhuai hua fa he PEG-yuan sheng zhi ti zhuai hua fa jin hang tiao jian you hua ,ran hou yi zhi fang mei wei mo shi mei zai hei qu mei zhong jin hang tong yuan /yi yuan zhi fang mei de biao da 。tong guo zhuai lu he zhuai lu hou shui ping gai zao di gao le hei qu mei zhi fang mei ANLde biao da liang ,bing jin hang le mei xue xing zhi yan jiu 。zui hou chu bu kai zhan le CRISPR/cas9ji shu zai hei qu mei biao da ji tong zhong de ying yong ,gou jian le niao mi ding que xian xing jun zhu 。zhu yao jie guo ru xia :（1）dui nong gan jun jie dao zhuai hua he PEG-yuan sheng zhi ti zhuai hua liang chong fang fa jin hang le tiao jian you hua 。you hua hou nong gan jun jie dao zhuai hua de tiao jian shi bu meng fa de xin xian bao zi yu OD600pei yang zhi 0.9-1.0de nong gan jun yi 1:1de bi li hun ge hou ,zai yi xian ding xiang tong nong du wei 200μmol·L-1de IMping ban shang ,23oCbi guang pei yang 48 hhou jin hang zhuai mo 。zui jia zhuai hua xiao lv da yao wei mei 106ge bao zi huo de 60±5ge zhuai hua zi ,bing ju yang xing lv bao chi zai 90%yi shang 。yuan sheng zhi ti zhi bei tiao jian wei :107ge ?mL-1hei qu mei bao zi jie chong PDAjin di ye ,30oC,200 r·min-1pei yang 24 h,shou ji jun si ti ,an zhi liang ti ji bi 1:10jia ru lie jie mei ye (0.8 mol·L-1MgSO4,1%qian wei su mei ,0.5%luo niu mei ,0.25%rong jun mei ),37oC,120 r·min-1mei jie 2.5 hhou shou ji yuan sheng zhi ti ,huo de yuan sheng zhi ti ge shu yao 6.8×105ge ?mL-1,yuan sheng zhi ti zai sheng lv yao 63±2.5%。（2）jiang tong yuan ji yi yuan dan bai zai hei qu mei zhong jin hang biao da ,yi yuan hua gen mei zhi fang mei RCLzai hei qu mei CICC2169zhong wei neng biao da ,tong yuan hei qu mei zhi fang mei ANLke yi biao da dan biao da liang jiao di 。qi dong zi zhuai lu shui ping fen xi ,you dao xing qi dong zi glaAzhuai lu shui ping xiang bi yu ye sheng xing di gao 50.35bei ,er zu cheng xing qi dong zi gpdAzhuai lu shui ping xiang bi yu ye sheng xing di gao 994.86bei 。chang shi 3chong fang shi lai di gao ANLde biao da shui ping ,bao gua bu chong nei han zi （di gao mRNAde wen ding xing ）、tian jia kozakxu lie （zeng jiang fan yi xiao lv ）、bu tong xin hao tai （zeng jiang dan bai bao wai fen bi xiao lv ）。zai jun shi glaAwei xin hao tai de qian di xia ,gai zao zhi qian chu shi zhuai hua zi jian ce bu dao mei huo li ,chan bu chong nei han zi de zhuai hua zi mei huo yao wei 75.80 U?mL-1,chan tian jia kozakxu lie de zhuai hua zi mei huo yao wei 61.33 U?mL-1,xin hao tai de ying xiang xiao guo wei cbhⅠsignal>ANL signal>glaA signal。zheng ge san chong ce lve ,biao da zui hao de zhuai hua zi wei kocbhS-ANL1000,zui gao mei huo da dao 314.67 U?mL-1。zai han you kozakxu lie de qian di xia ,ju you glaA、ANL、cbhⅠxin hao tai de bu chong nei han zi zhuai hua zi bi xiang ying de bu han nei han zi zhuai hua zi zhi fang mei fa jiao huo li fen bie di gao le 1.64bei 、1.94bei 、3.61bei 。mei xue xing zhi yan jiu biao ming ANLzui kuo pHwei 3.0,zui kuo wen du wei 45oC。（3）jiang CRISPR/cas9ji yin bian ji ji shu zai hei qu mei zhong ying yong ,jiang CRISPR/cas9zhi li tong guo yuan sheng zhi ti zhuai hua fa xiang hei qu mei zhuai hua bing shai shua zhuai hua zi 。sgRNAba xiang pyrGji yin ,shai shua zhuai hua zi huo de niao mi ding que xian xing jun zhu （?pyrG）,tong guo ce xu que ding tu bian wei dian ,que ding shi wei yu sgRNAou yu nei ,da ba xiao lv yao 25%。sgRNAba xiang hygji yin ,chang shi tong guo CRISPRba xiang hygji yin jin hang po huai ,dan shi wei huo de yang xing zhuai hua zi 。
论文参考文献
论文详细介绍
论文作者分别是来自江南大学的朱思远，发表于刊物江南大学2019-10-21论文，是一篇关于黑曲霉论文,脂肪酶论文,提高表达量论文,酶学性质论文,江南大学2019-10-21论文的文章。本文可供学术参考使用，各位学者可以免费参考阅读下载，文章观点不代表本站观点，资料来自江南大学2019-10-21论文网站，若本站收录的文献无意侵犯了您的著作版权，请联系我们删除。
标签：黑曲霉论文; 脂肪酶论文; 提高表达量论文; 酶学性质论文; 江南大学2019-10-21论文;