骨质疏松患者成骨细胞相关细胞因子蛋白表达与证型的相关性研究

论文摘要

目的:通过体外培养获得成骨细胞,借助抗体芯片技术检测OP患者成骨细胞相关细胞因子的变化,探讨骨质疏松患者成骨细胞相关细胞因子蛋白表达与“肾阴虚”、“肾阳虚”证型的相关联系,从而揭示骨质疏松症中医证型的本质,并为骨质疏松症中医证型的研究提供合理的客观化依据。方法:回顾近年来现代中医对骨质疏松症的研究进展、成骨细胞与骨代谢的关系、骨质疏松症证型的研究进展以及成骨细胞相关细胞因子与骨质疏松症关系的研究进展,并复习蛋白芯片技术和体外培养成骨细胞技术的概况,在此基础上进行相关的实验和临床研究。实验研究:从三组行全髋置换术的患者（肾阳虚组、肾阴虚组、正常对照组）股骨头松质骨中用改良酶消化法分离成骨细胞。通过倒置相差显微镜观察原代细胞的形态,并采用碱性磷酸酶染色和矿化结节染色鉴定成骨细胞。用流式细胞仪检测三组成骨细胞胞内Ca2+阳性百分比和荧光值,采用茜素红染色镜下观察三组成骨细胞钙化结节并计数。临床研究;选择肾阴虚型和肾阳虚型OP合并股骨颈或股骨粗隆间骨折的患者各8例,股骨颈或股骨粗隆间骨折患者无OP的患者8例,三组患者均行髋关节置换术。取出术中置换的股骨头,进行成骨细胞培养,经过鉴定,所培养的细胞具有典型的成骨细胞形态和功能。对三组患者的成骨细胞进行细胞因子抗体芯片的检测,从而筛选出肾阴虚组、肾阳虚组与正常组成骨细胞蛋白表达有差异的细胞因子,以及肾阴虚组、肾阳虚组之间蛋白表达有差异的细胞因子。结果:实验研究结果:在经酶消化过滤后,取得的成骨细胞刚接种入培养瓶时,是悬浮的单细胞,呈折光性较高的球形。2小时后开始有成骨细胞贴壁,到20小时后多数成骨细胞已贴壁。于接种两周左右成骨细胞生长满瓶壁,细胞密集,形态单一,呈长梭形,此时生长减慢,开始出现多层生长,并开始出现钙结节。细胞接种后第12天,行碱性磷酸酶染色,成骨细胞胞浆中出现黑色颗粒或块状沉淀,广泛分布于成骨细胞胞浆,成骨细胞纯度高。在抗坏血酸、β-甘油磷酸钠存在下,细胞培养18d可形成矿化结节,茜素红染色成红色。实验结果显示培养获得的原代细胞表现出成骨细胞的各种特征,ALP检测阳性,在含β-甘油磷酸钠和抗坏血酸的培养液中培养14-20d,可形成钙化结节,表明我们培养的细胞是成骨细胞,具有典型成骨细胞的形态和功能,而且纯度较高。流式细胞仪检测结果显示,正常组成骨细胞胞内Ca2+阳性百分比和荧光值均明显高于肾阳虚及肾阴虚组,其差异有显著性意义（P＜0.01）,肾阳虚组及肾阴虚组成骨细胞胞内Ca2+阳性百分比和荧光值无显著性差异（P＞0.05）。采用茜素红染色镜下观察,正常组成骨细胞钙化结节计数明显高于肾阳虚及肾阴虚组,其差异有显著性意义（P＜0.01）,肾阳虚组及肾阴虚组钙化结节计数无显著性差异（P＞0.05）。临床研究结果:与正常对照组相比,肾阳虚组和肾阴虚组OB的BMP-4、BMP-6、FasFGF-4、FasFGF-6、IGF-1、IL-6、IL-2、OPG等18种细胞因子蛋白表达水平明显上升或下降（P＜0.05,P＜0.01）,肾阴虚组OB的IL-6、TGF-1的蛋白表达水平较肾阳虚组高,差异有显著性（P＜0.05,P＜0.01）。OP患者中医证型的本质可能与OB相关细胞因子的蛋白表达密切相关,我们同时发现,蛋白表达有差异的细胞因子多是与骨代谢有关的,且其表达上升或下降与该细胞因子的功能密切相关。BMP-4、BMP-6、OPG是骨形成指标,其蛋白表达与正常对照组相比是明显上升的,而FasFGF-4、FasFGF-6、IGF-1、IL-6、IL-2等骨吸收指标,其蛋白表达与正常对照组相比是明显下降的。结论:1、改良酶消化法能获得体外培养研究所需要的高纯度成骨细胞。2、多种方法联合应用可作为体外成骨细胞培养的鉴定标准。3、生理状态下成骨细胞胞内Ca2+含量高于骨质疏松状态下的成骨细胞,但成骨细胞钙离子的摄取能力与“肾阴虚证”、“肾阳虚证”无明显相关。4、生理状态下的成骨细胞的钙化能力高于骨质疏松状态下的成骨细胞,但成骨细胞的钙化能力与“肾阴虚证”、“肾阳虚证”无明显相关。5、肾阴虚型和肾阳虚型OP患者成骨细胞具有相近的钙化能力和钙离子的摄取能力,骨质疏松证型实质的研究还需从更深层次探讨。6、骨质疏松症肾阴虚与肾阳虚证的物质基础可能是骨代谢相关细胞因子。肾阳虚证OB相关细胞因子的蛋白表达的变化趋势与肾阴虚组是基本一致的。7、成骨细胞IL-6、TGF-1蛋白表达程度的不同可能是OP患者肾阳虚证与肾阴虚证本质上的差异。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 前言
• 第一部分 文献研究
• 第一节 骨质疏松症的中医研究概述
• 1 中医对骨质疏松症的认识
• 2 中医学对骨质疏松症的现代研究
• 第二节 现代医学对骨质疏松症的研究概况
• 1 成骨细胞与骨代谢
• 2 蛋白质组学与中医证实质研究
• 第二部分 实验研究
• 第一节 材料与方法
• 1 实验用试剂及设备
• 2 病例来源
• 3 诊断标准
• 4 病例选择标准
• 5 纳入病例的一般临床资料
• 6 标本的采集
• 7 体外人成骨细胞的原代细胞培养和保存
• 8 成骨细胞钙离子摄取能力的测定
• 9 统计学处理
• 第二节 结果
• 1 形态学观察
• 2 碱性磷酸酶染色
• 3 矿化结节染色
• 4 成骨细胞钙离子摄取能力的测定结果
• 第三节 讨论
• 1 体外培养 OB的组织来源
• 2 OB的体外分离培养方法
• 3 原代细胞或传代细胞模型的选择
• 4 体外培养的成骨细胞的鉴定
• 5 成骨细胞钙离子摄取能力与OP证型的相关性
• 6 成骨细胞钙化能力与OP证型的相关性
• 第四节 结论
• 第三部分 临床研究
• 第一节 临床资料
• 1 病例选择（同实验研究部分）
• 2 诊断标准（同实验研究部分）
• 3 病例选择标准（同实验研究部分）
• 4 纳入病例的一般临床资料（同实验研究部分）
• 5 观测指标
• 第二节 成骨细胞体外培养和鉴定（同实验研究部分）
• 第三节 细胞因子抗体芯片检测过程
• 1 主要仪器
• 2 主要试剂
• 3 BAC蛋白定量
• 4 抗体蛋白芯片的检测
• 5 数据处理和统计分析
• 第四节 结果
• 1 样本工作浓度的确立
• 2 抗体芯片质量控制
• 3 抗体芯片检测结果
• 第五节 讨论
• 1 OP发生的细胞生物学基础
• 2 细胞因子与骨代谢
• 3 中医“证”的实质
• 第六节 结论
• 展望
• 参考文献
• 缩略词表
• 研究生在学期间发表论文情况
• 致谢