抗除草剂bar基因工程菌构建与草莓叶片再生体系的研究

论文摘要

为探索草莓抗除草剂bar基因转化高效方法,试验利用三亲杂交法,将构建的真核表达载体pBI121-bar转入根癌农杆菌菌株LBA4404,对菌落PCR、质粒PCR和质粒双酶切产物进行电泳检测,用构建的工程菌转化草莓试管苗。并且本试验以适合安徽省栽培的草莓（Fragaria ananassa Duch）优良品种——丰香为试材,通过对叶片愈伤组织诱导、生根培养筛选研究,建立起草莓简单、快速、高效的叶片离体再生体系,为草莓利用发根农杆菌进行抗除草剂bar基因转化研究奠定基础。试验研究获得的主要结果如下:1、利用三亲杂交法将真核表达载体pBI121-bar转入根癌农杆菌LBA4404,通过菌落PCR、质粒PCR、质粒双酶切电泳检测,证明工程菌构建成功。2、试验筛选出草莓试管苗、叶片愈伤组织分化阶段的适宜选择压分别是浓度为25 mg/L和20 mg/L的卡那霉素。3、对工程菌进行抗生素浓度的筛选,Cef与Carb有效抑菌浓度均为200 mg/L。4、不同6-BA、NAA组合对草莓叶片不定芽无诱导作用,只能诱导愈伤组织。5、应用SPSS软件分析,得出诱导叶片不定芽的最佳培养基是:MS+TDZ1.5mg/L+IBA 0.4 mg/L。6、丰香生根的最适培养基分别为是:1/2MS+IBA 0.1 mg/L。7、对发根农杆菌R1601抑制抗生素Carb浓度筛选,Carb有效除菌浓度为500mg/L。8、当发根农杆菌R1601的菌液OD600值=0.6时,对草莓叶片毛状根的诱导频率最高,而高于或低于该密度,诱导率都呈下降的趋势。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 英文缩略词
• 1 文献综述
• 1.1 草莓离体培养
• 1.1.1 花药培养
• 1.1.2 茎尖培养
• 1.1.3 叶片及匍匐茎的培养
• 1.2 抗除草剂转基因草莓研究进展
• 1.2.1 草莓的转基因研究现状
• 1.2.2 抗除草剂转基因草莓转化的主要方法
• 1.2.3 抗除草剂bar基因遗传转化的检测和鉴定方法
• 1.2.4 抗除草剂转基因草莓研究存在的问题
• 1.2.5 抗除草剂转基因草莓研究的未来发展方向
• 2 引言
• 3 材料与方法
• 3.1 材料
• 3.1.1 质粒与菌种
• 3.1.2 叶片培养材料
• 3.1.3 抗生素
• 3.1.4 培养基
• 3.2 试剂与仪器
• 3.2.1 主要试剂
• 3.2.2 主要仪器
• 3.3 方法
• 3.3.1 抗除草剂bar基因工程菌的构建
• 3.3.2 草莓叶片再生体系的研究
• 3.3.3 发根农杆菌复苏、培养及其诱导草莓叶片毛状根的研究
• 4 结果与分析
• 4.1 真核表达载体pBI121-bar转化大肠杆菌DH5α
• 4.1.1 感受态细胞的转化
• 4.1.2 转化菌落PCR鉴定
• 4.2 载体pBI121-bar转化农杆菌LBA4404
• 4.2.1 工程菌菌落PCR检测结果
• 4.2.2 工程菌质粒PCR检测结果
• 4.2.3 重组工程菌质粒双酶切
• 4.3 工程菌株的构建
• 4.4 两种不同方法对质粒提取的比较
• 4.5 卡那霉素（Kan）筛选浓度的确定
• 4.6 头孢噻肟钠（Cef）抑制转化农杆菌LBA4404浓度确定
• 4.7 羧苄青霉素（Carb）抑制转化农杆菌LBA4404浓度确定
• 4.8 草莓叶片再生体系的研究
• 4.8.1 不同浓度6-BA,NAA对草莓叶片再生的影响
• 4.8.2 不同浓度TDZ、IBA对草莓叶片再生的影响
• 4.9 不同浓度IBA对生根的影响
• 4.10 毛状根除菌用抗生素浓度的确定
• 4.11 草莓叶片毛状根的诱导
• 5 讨论
• 5.1 真核表达载体的转化农杆菌
• 5.2 抗生素浓度的筛选
• 5.3 草莓叶片再生体系的研究
• 5.4 不同浓度IBA对生根的影响
• 5.5 草莓叶片毛状根的诱导
• 6 结论
• 6.1 抗除草剂bar基因工程菌的构建
• 6.2 草莓选择压及工程菌抑制浓度的筛选
• 6.3 草莓叶片再生体系的研究
• 6.4 毛状根除菌用抗生素浓度的确定
• 6.5 草莓叶片毛状根的诱导
• 参考文献
• 附图表
• 附图1 工程菌的构建
• 附图2 试管苗、叶片对卡那霉素浓度的筛选
• 附图3 草莓叶片再生体系的研究
• 附图4 生根培养基诱导生根情况
• 附图5 发根农杆菌R1601的培养
• 附图6 毛状根除菌用抗生素浓度的确定
• 致谢
• 作者简介