呼肠孤病毒3型σ1蛋白在昆虫细胞中的表达及间接ELISA方法建立

论文摘要

呼肠孤病毒3型（Reo-3）是线性双链RNA病毒,属于呼肠孤病毒科。因其宿主类型广泛、可改变动物免疫功能等特点,使它成为实验动物必须检测的较为重要的病毒之一。鼠类感染呼肠孤病毒3型的临床表现主要有黄疸、运动失调、油性被毛、生长发育迟缓等,但又因其经常出现隐形感染,严重干扰动物实验,所以建立准确快速的Reo-3检测诊断方法很有必要。目前,实验动物呼肠孤病毒3型的诊断方法主要有组织观察法、病毒分离鉴定法、RT-PCR法、免疫荧光法、免疫酶法和ELISA法等。相比而言,ELISA法的灵敏性高,重复性较好,操作也较便捷。因此,建立一套完备的呼肠孤病毒3型的ELISA鉴定方法是很有必要的。呼肠孤病毒3型的σ1蛋白在免疫介导中起着重要作用,因此选择σ1蛋白的编码基因S1基因为目的基因。根据GenBank数据库中的Reo-3-S1基因序列设计一对引物,用RT-PCR技术从本站保存的由中国药品生物制品检定所提供的呼肠孤病毒3型毒株中获得大小为1416bp（S1）的PCR产物。将其克隆至pMD18-T载体,提取质粒经SpeⅠ和HindⅢ双酶切鉴定并测序。测序结果表明,克隆的G1蛋白基因完全符合载体阅读框,扩增的S1基因与Reo-3核昔酸序列符合率100%,氨基酸符合率100%。将质粒与穿梭载体pFastBacTMTA分别进行双酶切,经回收后连接。连接产物转化DH5a,得到重组转移质粒pFastBHA-S1。提取阳性克隆质粒转化到含阳性克隆穿梭载体Bacmid的受体菌DH10Bac中。筛选出阳性菌落得到重组穿梭载体Bacmid-S1,提取质粒,经PCR鉴定为阳性后,转染Sf9昆虫细胞,7天后收获病毒。经PCR、IFA、SDS-PAGE和Western-blot鉴定S1基因的转录和表达。结果表明,重组杆状病毒σ1蛋白（约51KD）在Sf9昆虫细胞中得到表达,并具有抗原性。σ1重组蛋白经镍离子亲和树脂纯化后,做了多抗血清,同时作为包被抗原,确定了最佳优化条件和结果判定标准。通过特异性试验证明包被的抗原仅与REO-3标准阳性血清发生反应,不与小鼠肝炎病毒,小鼠肺炎病毒,仙台病毒,鼠痘病毒等疫病的标准阳性血清发生交叉反应。对相同的血清样品进行了4次重复性实验,变异系数小于16%。保存期实验表明,在4℃和-20℃保存良好。因此本试验成功的建立了检测REO-3血清抗体的间接ELISA方法。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 符号说明
• 文献综述
• 1 呼肠孤病毒3型概述
• 1.1 呼肠孤病毒的发现与分类特点
• 1.2 形态特点与理化性质
• 1.3 血凝特性及培养特性
• 1.4 基因组结构
• 1.5 病毒蛋白
• 1.6 病毒转录与复制
• 1.7 流行病学
• 1.8 临床特征和病理变化
• 1.9 呼肠孤病毒3型的预防与控制
• 1.10 诊断方法
• 2 研究目的及意义
• 研究报告一 S1基因的克隆、真核表达纯化及多抗制备
• 1 材料
• 1.1 毒株、质粒、菌株和细胞
• 1.2 主要试剂与溶液
• 1.3 主要仪器与耗材
• 2 方法
• 2.1 引物设计
• 2.2 克隆目的基因S1
• 2.3 利用Bac-To-Bac杆状病毒表达系统构建重组杆状病毒
• 2.4 目的蛋白纯化
• 2.5 多抗血清的研制及鉴定
• 3 结果
• 3.1 S1基因的PCR扩增
• 3.2 S1基因的克隆及鉴定
• 3.3 序列测定
• 3.4 重组供体质粒pFastHTA-S1的酶切鉴定
• 3.5 PCR鉴定重组构建Bacmid-S1 DNA
• 3.6 重组病毒rBS的获得
• 3.7 表达产物的IFA检测
• 3.8 表达产物的Western-blotting检测
• 3.9 重组蛋白的纯化
• 3.10 多抗血清的研制及鉴定
• 4 讨论
• 研究报告二 间接ELISA诊断方法的建立
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 间接ELISA操作程序
• 1.3 间接ELISA诊断方法的建立
• 1.4 方法性能评价
• 2 结果
• 2.1 间接ELISA诊断方法的建立
• 2.2 方法性能评价
• 3 讨论
• 3.1 ELISA条件优化
• 3.2 REO-3间接ELISA诊断方法的判定标准及应用
• 结论
• 参考文献
• 课题来源
• 致谢
• 攻读硕士期间发表的学术论文
• 附录