黄芪多糖联合丁酸钠对K562细胞及人红系细胞胎儿血红蛋白合成作用的研究

论文摘要

背景与目的β-珠蛋白生成障碍性贫血（β-thalassemia,β-地贫）是一种常见的单基因遗传病,对人类健康危害很大,是由于p-珠蛋白基因的缺失或缺陷使p-珠蛋白链合成减少,导致相对过剩的α-肽链形成包涵体沉积于细胞膜上,引起红细胞变形能力下降,在脾脏内被大量破坏所致的一组遗传性溶血性疾病。目前p-地贫的根治方法只有骨髓移植,但由于配型的限制、实施中的风险、以及昂贵的费用,在我国也只能用于极少数的重症地贫患者。理论上基因矫正治疗是最理想方案,但因珠蛋白基因的红系组织特异性、发育阶段特异性、表达调控的复杂性及基因矫正治疗许多技术难题尚未解决,致使对基因矫正仍处于探索阶段。多年来人们也致力于γ珠蛋白基因诱导剂的研究,即重新激活已近乎关闭的Y珠蛋白基因表达,合成Y链以替代缺陷的p珠蛋白链与相对过剩的α链构成胎儿血红蛋白（fetal hemoglobin,HbF）,降低α链与非α链之间的不平衡；或通过改变红系细胞分化动力学来增加仍保持γ珠蛋白基因表达能力的红细胞群落,以达到减少溶血,缓解贫血症状的目的。迄今为止,已发现能诱导Y珠蛋白基因表达促进胎儿血红蛋白（HbF）生成的药物主要有：（1）细胞毒素剂,如羟基尿（HU）、阿糖胞苷、长春新碱、氨甲喋呤、顺铂及阿霉素衍生物等。（2）DNA甲基转移酶（DNA Methyltransferase,DNMT）抑制剂,如5-氮杂孢苷（5-AZAC）及地西台宾等氮胞核苷类药物。（3）组蛋白脱乙酰基酶（histone deacetylase, HDAC）抑制剂,如丁酸盐类（butyrate）及其衍生物、apicidin等。其中HU和NaB是近年研究较多的两种药物,HU是一种细胞毒性γ珠蛋白基因诱导剂,是唯一通过美国FDA批准用于治疗镰状细胞贫血的药物,对轻型、中间型p地贫疗效明显,但对重型患者疗效不稳定,长期使用存在致畸变、细胞毒性等毒副作用。丁酸盐是一类组蛋白脱乙酰基酶抑制剂,对p-地贫有较好疗效,但其血浆半衰期短（5～10分钟）,口服剂量大,且合成困难、价格昂贵,限制了临床的广泛应用,因此迫切需要更有效且安全的新药开发及新的治疗策略来解决这些问题。新的化学药物开发花费大且耗时长,而具有中国传统特色的天然中药不良反应轻,药源丰富,价格合适,具有良好的研究开发前景,已有实验研究发现当归根素、白藜芦醇等天然药物提取物能有效上调Y珠蛋白基因表达,但尚未用于临床。在新药开发的同时,联合用药治疗成为研究药物诱导γ珠蛋白基因表达的一个重要策略。联合各药物不同作用机制及靶点,协同上调γ珠蛋白基因表达,并降低用药剂量减轻细胞毒性成为治疗的关键；已有较多学者对HU与NaB、HU与EPO等联合用药进行了研究,证明联合用药能协同诱导HbF生成,但由于实验对象、基因型、用药剂量、样本量等多方面因素导致研究结果不一致。目前研究较多的γ基因诱导剂多为细胞毒类药,药物联合虽然可降低用药剂量减轻细胞毒性,但p-地贫的治疗是一个长期的终生治疗,其远期疗效及毒副作用尚不确切,需继续深入研究,寻找发现更有效且安全的治疗方案。我们通过中药血清学方法和现代分子生物学技术从临床上对p-珠蛋白生成障碍性贫血有治疗效果的方剂中筛选出单味中药黄芪,并且进一步分离其有效成分,鉴定黄芪多糖（APS）是一种有效的γ珠蛋白基因诱导剂,对细胞生长抑制作用较小且作用持续时间较长。黄芪具有补气升阳、固表止汗、托毒排脓、利水消肿、敛疮生肌等功能,毒理学研究也显示黄芪毒性很低,急、慢性毒理学实验均未见明显毒副作用,因此黄芪是一种安全性较高的中药。APS具有刺激造血的作用,可以提高红系集落形成单位（colony-forming unit-erythroid, CFU-E）和红系爆式集落形成单位（burst formingunits-erythroid, BFU-E）的形成率,从而增加红细胞数量与血红蛋白量。APS在刺激骨髓造血、增强免疫功能及抗肿瘤方面的作用已得到学术界的普遍认可。本课题组前期研究将APS与半衰期短、口服剂量大的NaB联合,证实其能更有效诱导红系分化,调节γ珠蛋白基因表达,但γ珠蛋白基因的上调是否能够使HbF表达增强尚未被证实。本研究旨在探讨黄芪多糖联合丁酸钠对K562细胞及人红系细胞HbF合成的作用。首先以具有向红系分化能力的人红白血病细胞系K562细胞为模型,通过联苯胺染色实验观察药物诱导细胞红系分化情况,再用比K562细胞更能模拟人体内红细胞生成过程的二步液体培养的人红系细胞为模型,用Western blotting分析低剂量黄芪多糖、丁酸钠联合用药对K562细胞及人红系细胞HbF合成的作用,并用台盼蓝拒染活细胞计数实验观察药物对细胞的生长抑制率。研究结果将为研究诱导γ珠蛋白基因表达的联合用药增添新的科学数据,为临床联合用药方案及实施提供实验依据。方法1.材料来源人红白血病细胞系K562购自中国科学院上海细胞库；脐血来源于南方医院产科健康产妇分娩胎儿脐带。2.实验分组实验共包括5组:APS 2.5 mg/ml+NaB 250μmol/L为实验组,APS 2.5 mg/ml、NaB 250μmol/L为低剂量单药组,NaB 500μmol/L为阳性对照组,空白对照组为未加药组。3.K562细胞培养：K562细胞呈悬浮生长,培养于含10%胎牛血清,青霉素、链霉素各100U/mL,2 mmol/L谷氨酰胺的RPMI-1640培养基中,在37℃、5%CO2条件下培养。4.人红系细胞二步液体培养：从脐血中分离单个核细胞,分两步在两种不同的培养体系中进行人红系细胞的体外培养,在第2阶段的第6天按所需终浓度加药,第14天结束培养。5.台盼蓝拒染活细胞计数实验观察药物对细胞生长抑制的影响。6.联苯胺染色实验观察APS、NaB联合用药诱导K562细胞红系分化的程度。7. Western blotting分析APS、NaB联合用药后K562细胞及人红系细胞HbF表达水平。8.统计学方法采用SPSS13.0统计软件进行分析。实验数据采用均数±标准差表示,细胞生长抑制率、联苯胺染色阳性率比较采用析因分析；多组间均数比较采用One-way ANOVA,post hoc test方差齐性采用LSD法,方差不齐的采用DunnettT3法；P<0.05有统计学意义。结果1 APS、NaB联合用药对细胞生长的抑制作用1.1 APS、NaB联合用药对K562细胞生长的抑制作用APS 2.5mg/ml+NaB 250μmol/L作用K562细胞96h,细胞生长抑制率及细胞活力分别为（67.47±3.76）%和（91±1.3）%,与NaB500μmol/L组（88.86±1.53）%和（74±2.4）%比较差异均有统计学意义（P<0.05）。1.2 APS、NaB联合用药对人红系细胞生长的抑制作用在培养第二阶段d6加药后,不同浓度的APS和NaB对人红系细胞均存在不同程度的抑制作用（F=18.616,P=0.000）。随着药物作用时间的延长,APS2.5mg/ml+NaB 250μmol/L组抑制率的峰值（36.84±1.27）%出现在用药后第4天（即d10）,小于NaB 5001μmol/L组（44.55±2.83）%（P<0.05）。2 APS、NaB联合用药对K562细胞红系分化的作用不同组别间联苯胺染色阳性率（BZ%）有显著差异（F=7185.879,P=0.000）,低剂量联药组BZ%最高；用药后不同时间点之间BZ%有显著性差异（F=1519.977,P=0.000）,72h及96h BZ%较高；不同用药组在不同时间点的BZ%存在交互效应（F=501.890,P=0.000）,说明不同用药组的BZ%差异随时间变化而变化,在96小时差异达到最大。APS2.5mg、NaB250μM联合用药可诱导K562细胞向红系分化,于48-144小时BZ%增高显著,96小时达高峰BZ%为（32.89±0.24）%,与常规剂量组NaB500μM（14.66±0.17）%比较增高有显著意义（P<0.05）；与单药低剂量组APS2.5mg （7.72±0.12）%、NaB250μM （7.58±1.46）%比较均增高有显著性意义（P<0.05）。而常规剂量NaB组BZ%峰值在72h,并在96h以后急剧下降。3 APS、NaB联合用药对K562细胞HbF合成的作用APS 2.5mg/ml+NaB 250μmol/L、NaB 500μmol/L分别诱导K562细胞72h及96h,HbF合成均增强（F=31.181,P=0.010；F=32.845,P=0.009）,分别增加至未加药组的（1.69±0.14）、（1.67±0.10）倍和（1.82±0.16）、（1.57±0.08）倍,诱导前后差别有显著性意义（P<0.05）。低剂量联药组HbF表达水平较常规剂量NaB组稍高,但差异无统计学意义（P>0.05）。4 APS、NaB联合用药对人红系细胞HbF合成的作用APS 2.5mg/ml+NaB 250μmol/L、NaB 500μmol/L分别诱导人红系细胞12天,HbF合成增强（F=34.674,P=0.008）,分别增加至未加药组的（1.964±0.18）和（1.78±0.10）倍,诱导前后差别有显著性意义（P<0.05）。低剂量联药组HbF表达水平较常规剂量NaB组稍高,但差异无统计学意义（P>0.05）。结论1.实验证实低剂量APS、NaB联合用药能使K562细胞HbF合成增强,与常规剂量NaB单药作用相同。2.实验证实低剂量APS、NaB联合用药能使人红系细胞HbF合成增强,与常规剂量NaB单药作用相同。3.进一步证实APS+NaB低剂量联合用药比NaB常规剂量单独用药能更有效诱导K562细胞向红系分化。4.低剂量APS、NaB联合用药诱导K562细胞红系分化作用持续时间较常规剂量NaB组持久。5.与常规剂量NaB单药组相比,低剂量APS、NaB联合用药减轻了细胞生长抑制及细胞毒性。6.本实验结果为临床低剂量联合用药提供理论依据。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 第一部分 黄芪多糖、丁酸钠联合用药对K562细胞 胎儿血红蛋白合成的作用
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 第二部分 黄芪多糖、丁酸钠联合用药对人红系细胞 胎儿血红蛋白合成的作用
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 全文小结
• 文献综述
• 参考文献
• 中英文对照缩略词表
• 硕士期间发表论文
• 致谢
• 统计学证明