四种抑癌基因p16、RASSF1A、CDH1、CDH13的甲基化状态及甲基转移酶活性和转录与肺癌的相关性研究

论文摘要

目的1、研究四种抑癌基因（p16、RASSF1A、CDH1、CDH13）甲基化在肺癌诊断中的意义;2、在肺癌细胞株中检测DNMTs与抑癌基因甲基化状态的关系,观察去甲基化处理后,四种抑癌基因的转录水平及肺癌细胞生长增殖的变化。方法1、筛选77例疑诊肺癌患者为研究对象,根据支气管镜检查及相关检查结果,将77例实验对象分为三组:第一组:肺癌组;第二组:良性肺病组;第三组:需定期随访组。收集支气管肺泡灌洗液（BALF）标本,采用MSP（Methylation-specific PCR）法分别检测BALF中p16、RASSF1A、CDH1、CDH13的甲基化状态;2、采用5-Aza-CdR去甲基化处理A549肺癌细胞株,MSP法检测去甲基化前后四种抑癌基因的甲基化状态变化。半定量RT-PCR检测癌细胞株DNMT1、DNMT3b、p16、RASSF1A、CDH13、CDH1的mRNA转录水平变化;酶活性连续循环比色法检测DNMTs的催化活性;流式细胞术（FCM）及MTT法检测癌细胞的生长状态。结果1、BALF中肺癌组47例,p16、RASSF1A、CDH1、CDH13的甲基化阳性率分别为32%、40%、32%、28%。良性肺病13例,上述四种基因甲基化阳性率分别为0%、8%、0%、8%。肺癌组p16、RASSF1A、CDH13三种甲基化阳性率大于良性肺病组（P<0.05）。47例肺癌患者中四种基因甲基化率在鳞癌和腺癌中均无统计学意义（P>0.05）。随访组中p16、RASSF1A、CDH1、CDH13的甲基化阳性率分别为18%、12%、12%、12%,p16、CDH1、CDH13在肺癌组和随访组之间差异无统计学意义（P>0.05） ;2、肺癌组四种抑癌基因中至少一个发生甲基化的百分比为79%。任意三个抑癌基因的组合,至少一个阳性的百分比分别为62%、72%、68%、72%。三基因组合与四基因组合的阳性率差别无统计学意义（P>0.05）;RASSF1A、CDH1组合至少一个基因发生甲基化的阳性率62%,与四基因组合甲基化阳性率也没有统计学意义（P>0.05）应用四基因联合诊断肺癌的敏感性为79%,特异性为85%;3、A549细胞株中去甲基化处理后,在A549细胞株中完全甲基化的抑癌基因CDH13发生部分去甲基化,mRNA转录水平前后分别为:p16（0.31±0.13; 0.37±0.10）,RASSF1A（0.14±0.06; 0.47±0.13）,CDH1（0.22±0.11; 0.36±0.14）,CDH13（0.36±0.16; 0.54±0.15）。CDH13、RASSF1A、CDH1的mRNA转录水平增高（P<0.05）,p16基因的mRNA转录增加无统计学意义（P>0.05）;4、5-Aza-CdR处理前后DNMTs的转录水平分别为: DNMT1（1.23±0.253 ,1.15±0.166）、DNMT3b （0.760±0.164, 0.649±0.181） ,两组无统计学差异（P>0.05）。去甲基处理组DNMTs催化活性下降,处理前后DNMT1（0.195±0.030, 0.153±0.041）、DNMT3b（0.172±0.029, 0.116±0.050）（P<0.05）。FCM结果提示细胞周期阻滞于G1/G0,两组凋亡率分别为0.62±0.56, 7.60±1.92,凋亡率明显增加（P<0.01）。MTT结果示去甲基化组细胞生长受抑制。结论本研究中BALF的p16、RASSF1A、CDH1、CDH13甲基化状态与肺癌的发生相关;四种抑癌基因中任意三种基因的甲基化状态测定,在肺癌诊断中具有良好的特异性和敏感性;5-Aza-CdR去甲基化处理A549肺癌细胞株后,DNMT1及DNMT3b活性下降,其转录水平不受影响;RASSF1A、CDH1、CDH13的转录水平增高,p16的转录无明显变化。去甲基化处理导致A549细胞增殖受抑,凋亡率增加。

论文目录

• 英语缩略词说明
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 实验材料
• 实验方法步骤及结果
• 实验一 支气管肺泡灌洗液中p16、RASSF1A、CDH1、CDH13 甲基化水平检测
• 实验二 A549 肺癌细胞株去甲基化前后甲基转移酶转录、活性和p16、RASSF1A、CDH1、CDH13 甲基化水平检测
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 综述及参考文献
• 参考文献
• 攻读硕士学位期间发表论文情况
• 致谢