miR-19a和miR-19b对宫颈癌细胞生长的影响及其靶基因的研究

论文摘要

[研究目的]微小RNA（microRNA, miRNA）是一类长度约18-26nt的小分子非编码RNA,通过负性调节其靶基因的表达水平参与多种生理、病理过程。近几年的研究表明,许多miRNA具有癌基因或抑癌基因活性,在肿瘤发生和发展过程中发挥重要作用。据报道,在人宫颈癌组织中microRNA-19a （miR-19a） microRNA-19b （miR-19b）是相对高表达的,本研究应用Real-time PCR技术证了这一结果,然后研究了miR-19a、miR-19b对宫颈癌细胞生长表型的影响,进而确定miR-19a、miR-19b直接作用的共同靶基因,从而阐明miR-19a、miR-19b对宫颈癌发生和发展发挥作用的可能分子机制。[方法]首先应用Real-time PCR技术检测miR-19a、miR-19b在人宫颈癌组织和癌旁正常组织中的差异表达。然后在人宫颈癌细胞系HeLa细胞中,过表达和封闭（?）niR-19a、miR-19b,利用WST-1实验、细胞集落形成实验、Trasnwell实验等检测细胞生长活性的变化。之后综合利用生物信息学方法筛选出miR-19a、 miR-19b的候选靶基因,并利用荧光报告载体实验验证miR-19a、miR-19b对靶基因的直接调控作用。通过Real-time PCR和Western blot技术检测宫颈癌细胞和宫颈癌组织中内源性靶基因mRNA水平和蛋白水平的表达变化,进一步验证miR-19a、miR-19b对靶基因的调控作用。最后利用RNA干扰技术沉默靶基因,通过WST-1实验、细胞集落形成实验、Trasnwell实验等检测细胞生长活性的变化,进一步研究靶基因的功能。[结果]Real-time PCR结果显示miR-19a、miR-19b在人宫颈癌组织中的表达明显高于癌旁正常组织。在宫颈癌细胞中,过表达miR-19a、miR-19b后细胞增殖活性,集落形成能力,细胞的侵袭能力均增强；封闭miR-19a、miR-19b后表型正好相反。靶基因筛选结果表明,胰岛素样生长因子Ⅱ受体（IGF2R）作为一种抑癌基因,是miR-19a、miR-19b的共同候选靶基因,其3’非翻译区包含miR-19a、 miR-19b相同的潜在结合位点。荧光报告载体实验表明,miR-19a、miR-19b能够通过作用于IGF2R基因的3’非翻译区（3’untranslated region,3’UTR）的特定位点,对其表达进行负性调节。而在miR-19a、miR-19b过表达的宫颈癌细胞中,IGF2R基因的mRNA表达水平和蛋白表达水平都有明显下降。将IGF2R基因沉默以后,细胞增殖能力增强,细胞集落形成和侵袭能力也明显增强。[结论]miR-19a、miR-19b能够促进宫颈癌细胞的增殖,起到癌基因的作用。IGF2R基因的mRNA表达水平和蛋白表达水平都有明显下降。将IGF2R基因沉默以后,细胞增殖能力增强,细胞集落形成和侵袭能力也明显增强。[结论]miR-19a、miR-19b能够促进宫颈癌细胞的增殖,起到癌基因的作用。在宫颈癌细胞中,高表达的miR-19a、miR-19b对抑癌基因IGF2R表达水平的抑制能力增强,使IGF2R的抑制增殖活性减弱,造成宫颈癌细胞生长速度加快。通过阐明miR-19a、miR-19b在宫颈癌中的具体作用机制及其靶基因的研究有利于我们对宫颈癌的发生发展进行深入的理解,同时也为临床上宫颈癌的诊断和治疗提供一条新的途径。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 符号说明
• 前言
• 研究现状、成果
• 研究目的、方法
• 一、miR-19a和miR-19b在宫颈癌中的作用研究
• 1.1 材料和方法
• 1.1.1 实验材料
• 1.1.2 实验方法
• 1.2 结果
• 1.2.1 Real-time PCR检测miR-19a、miR-19b在宫颈癌组织和正常宫颈组中的差异表达
• 1.2.2 pcDNA3/pri-miR-19a、pcDNA3/pri-miR-19b质粒的构建
• 1.2.3 细胞转染效率检测
• 1.2.4 Real-time PCR检测pcDNA3/pri-miR-19a、pcDNA3/pri-miR-19b质粒的有效性
• 1.2.5 WST-1实验检测miR-19a、miR-19b对宫颈癌细胞生长活性的影响
• 1.2.6 细胞集落形成实验检测miR-19a、miR-19b对宫颈癌细胞集落形成能力的影响
• 1.2.7 生长曲线实验检测miR-19a、miR-19b对宫颈癌细胞增值能力的影响
• 1.2.8 划痕实验检测miR-19a、miR-19b对宫颈癌细胞体外迁移能力的影响
• 1.2.9 Transwell检测miR-19a、miR-19b对宫颈癌细胞侵袭能力的影响
• 1.3 小结
• 二、miR-19a和miR-19b在宫颈癌中靶基因的确定及验证
• 2.1 材料和方法
• 2.1.1 实验材料
• 2.1.2 实验方法
• 2.2 结果
• 2.2.1 EGFP荧光报告载体的构建
• 2.2.2 EGFP荧光报告载体实验验证IGF2R是miR-19a、miR-19b的直接作用靶基因
• 2.2.3 Real-Time PCR方法检测在过表达和封闭miR-19a、miR-19b后的HeLa细胞中IGF2R mRNA的表达水平
• 2.2.4 Western blot检测在过表达miR-19a、miR-19b后的HeLa细胞中IGF2R蛋白的表达水平
• 2.3 小结
• 三、靶基因IGF2R在宫颈癌中的作用研究
• 3.1 材料和方法
• 3.1.1 实验材料
• 3.1.2 实验方法
• 3.2 结果
• 3.2.1 pSilencer/si-IGF2R质粒的构建
• 3.2.2 Western blot验证pSilencer/si-IGF2R质粒的有效性
• 3.2.3 WST-1检测基因IGF2R对宫颈癌细胞生长活性的影响
• 3.2.4 细胞集落形成实验分析IGF2R对宫颈癌细胞集落形成能力的影响
• 3.2.5 生长曲线实验检测IGF2R对宫颈癌细胞增殖能力的影响
• 3.2.6 划痕实验检测IGF2R对宫颈癌细胞体外迁移能力的影响
• 3.2.7 Transwell检测IGF2R对宫颈癌细胞侵袭能力的影响
• 3.3 小结
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 发表论文和参加科研情况说明
• 综述
• 综述参考文献
• 致谢