绿色荧光蛋白标识小鼠胸腺免疫抑制作用的研究

论文摘要

绿色荧光蛋白（GFP）作为生物标记物,已被广泛应用于多个研究领域,并获得了丰富的成果。本文即以绿色荧光蛋白为标识物,通过环磷酰胺建立小鼠免疫模型,并以肽聚糖调节小鼠免疫功能,探讨绿色荧光蛋白在小鼠免疫功能受抑制和恢复状态中的表达,以及其表达与调节剂的作用程度、时间之间的关系,为适时研究小鼠免疫功能提供新的方法。首先,以阳离子聚合物为载体,体外转染GFP基因至小鼠胸腺、肝、脾细胞,筛选出GFP表达率较高的细胞作为研究对象。体外转染后36h,GFP在胸腺细胞中的表达率达到90%以上,脾、肝细胞中的表达率则低于10%。选择胸腺细胞为对象,试验不同锌源及剂量对GFP表达的影响,以建立营养素调控模型,但两种锌对GFP表达没有明显的促进作用。体内试验中,选择环磷酰胺来调节小鼠机体的免疫功能,研究GFP在胸腺中的表达与小鼠免疫功能之间的关系。环磷酰胺的免疫抑制作用具有剂量效应,当剂量为100mg/kg时,小鼠胸腺明显萎缩,同时,GFP表达率大幅度下降。正常的小鼠胸腺中,转染后72-80h时GFP表达率达到最大值,在90%以上。而转染24h后注射100mg/kg剂量环磷酰胺的小鼠,在CY注射18h时,小鼠免疫功能受到的抑制作用达到最大,此时胸腺中GFP的表达率也达到最大值,约18%。CY注射后18h48h之间,GFP表达阳性率逐渐降低,表明不仅环磷酰胺的免疫抑制作用具有时间效应,GFP的表达及在细胞中的存在也具有时间效应。最后,本文以肽聚糖来拮抗环磷酰胺的抑制作用,并通过GFP的表达观察其效果,证明GFP在此模型中的作用以及模型的应用性。在注射转染液和环磷酰胺前,试验组小鼠连续三天注射肽聚糖,每天25mg/kg。联合注射肽聚糖的试验组,小鼠胸腺中的GFP+细胞数比CY抑制组高63.1%,总细胞数为CY抑制组的1.26倍,GFP+阳性率为CY抑制组的1.29倍,差异显著（P<0.05）。但是,和对照组相比,试验组小鼠胸腺的GFP+细胞数、总细胞数和GFP+阳性率分别为对照组的62.9%、76.6%和82.1%,差异显著（P<0.05）。

论文目录

• 目录
• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
• 1.1 绿色荧光蛋白的性质和研究进展
• 1.1.1 GFP 的结构和性质
• 1.1.2 GFP 基因的克隆及特征
• 1.1.3 GFP 的发光机制
• 1.1.4 GFP 的应用
• 1.1.4.1 研究基因表达的调控元件和蛋白质定位
• 1.1.4.2 研究基因表达的时序控制与空间定位
• 1.1.4.3 发育分子机理研究
• 1.1.4.4 筛选新的药物
• 1.1.4.5 用于临床检验
• 1.1.4.6 在其它方面的应用
• 1.2 基因转染方法的发展和现状
• 1.2.1 磷酸钙共沉淀
• 1.2.2 电穿孔法
• 1.2.3 逆转录病毒载体技术
• 1.2.4 显微注射技术
• 1.2.5 阳离子脂质体法
• 1.3 立题背景和意义
• 1.4 本课题研究的主要内容
• 第二章 GFP 标识小鼠免疫抑制模型的初步建立
• 2.1 前言
• 2.2 实验材料与设备
• 2.2.1 主要实验材料
• 2.2.2 主要仪器
• 2.2.3 pEGFP-c3 质粒的提取与鉴定
• 2.2.4 体外转染试验
• 2.2.4.1 转染液的配制
• 2.2.4.2 胸腺细胞体外转染试验
• 2.2.4.3 脾细胞体外转染试验
• 2.2.4.4 肝细胞体外转染试验
• 2.2.4.5 锌对GFP表达的影响
• 2.2.5 小鼠体内转染及免疫抑制试验
• 2.2.5.1 试验动物和分组
• 2.2.5.2 试验处理
• 2.2.6 胸腺细胞免疫抑制的检测
• 2.2.6.1 胸腺细胞悬液的制取
• 2.2.6.2 单细胞凝胶电泳
• 2.2.7 数据处理
• 2.3 实验结果
• 2.3.1 质粒鉴定
• 2.3.2 体外转染试验结果
• 2.3.3 锌对GFP表达的影响
• 2.3.4 体内转染结果
• 2.3.4.1 细胞活力检测
• 2.3.4.2 不同剂量的CY 对小鼠脏器指数的影响
• 2.3.4.3 不同剂量的CY 对小鼠转染结果的影响
• 2.3.5 胸腺免疫抑制与GFP 转染阳性率回归分析
• 2.3.6 胸腺细胞免疫抑制的检测
• 2.3.6.1 细胞活力测定
• 2.3.6.2 单细胞凝胶电泳
• 2.3.6.2.1 拖尾细胞尾长
• 2.3.6.2.2 拖尾细胞百分率
• 2.4 讨论
• 2.5 本章小结
• 第三章 环磷酰胺对小鼠胸腺免疫抑制的研究
• 3.1 前言
• 3.2 实验材料与设备
• 3.2.1 主要实验材料
• 3.2.2 主要仪器
• 3.2.3 质粒提取与鉴定
• 3.2.4 小鼠转染及免疫抑制试验
• 3.2.4.1 试验动物和分组
• 3.2.4.2 试验处理
• 3.2.5 数据处理
• 3.3 实验结果
• 3.3.1 质粒鉴定
• 3.3.2 细胞活力检测
• 3.3.3 CY 作用不同时间对小鼠胸腺指数、细胞总数的影响
• 3.3.4 CY 作用不同时间对转染小鼠胸腺细胞的影响
• 3.3.5 荧光显微镜下的检测结果
• 3.3.6 对胸腺指数的回归分析
• 3.4 讨论
• 3.5 本章小结
• 第四章 肽聚糖对环磷酰胺免疫抑制的调节作用研究
• 4.1 引言
• 4.2 材料及方法
• 4.2.1 实验材料
• 4.2.2 主要仪器
• 4.2.3 PG 对CY 免疫细胞抑制的拮抗作用研究
• 4.2.3.1 试验动物和分组
• 4.2.3.2 脾、胸腺指数和胸腺细胞数测定
• 4.2.3.3 PG、CY对小鼠胸腺细胞转染的影响
• 4.2.4 数据处理
• 4.3 实验结果
• 4.3.1 细胞活力检测
• 4.3.2 PG 对CY 诱导免疫抑制的拮抗作用
• 4.3.3 PG 和CY 同时作用对小鼠胸腺细胞转染的影响
• 4.3.4 荧光显微镜下的检测结果
• 4.4 讨论
• 4.5 本章小结
• 主要结论
• 参考文献
• 致谢
• 附录