小麦T型CMS恢复基因的遗传分析及育性相关基因的克隆与功能研究

论文题目: 小麦T型CMS恢复基因的遗传分析及育性相关基因的克隆与功能研究

论文类型: 博士论文

论文专业: 植物学

作者: 赵宝存

导师: 黄占景,沈银柱

关键词: 小麦,型细胞质雄性不育,基因,近等基因系,回交扣除杂交,群分法

文献来源: 河北师范大学

发表年度: 2005

论文摘要: 目前,小麦杂种优势利用并未取得突破性进展。原因之一是小麦是异源六倍体自花授粉作物,具有庞大的基因组,加之长期人工选择的结果,遗传多样性较差,品种间杂种优势不够理想,增产幅度不十分突出;原因之二是生产上应用的T型细胞质雄性不育系保持容易恢复难。所以,培育新型恢复系,加强对小麦新型强优势组合的筛选有非常重要的作用。本论文就T型恢复系7269—10恢复基因的遗传规律进行分析,并进一步克隆育性相关基因,为推进小麦杂种优势在生产中的应用奠定理论和实验基础。以细胞质雄性不育系75-3369A、恢复系7269-10及75-3369A/7269-10组合的F2群体和F3群体为材料,连续三年对F2的育性分离情况进行了统计,并结合F3家系的育性分离情况对恢复基因的遗传规律进行了分析。结果表明,恢复系7269-10育性恢复的遗传主要受两对显性恢复基因控制,且非等位恢复基因之间存在加性效应。鉴于F2的育性恢复即有质量性状的特征,又有数量性状的特征,并且易受环境因素的影响,推测该育性恢复性状还受微效恢复因子的影响。利用杂交、回交和自交育成了关于小麦T型CMS育性恢复基因的拟近等基因系（INIL）和近等基因系（NIL）,可用于恢复基因定位及分离等研究。以细胞质雄性不育系75-3369A和恢复系7269-10的F2群体为材料,利用扣除杂交结合BSA法分离育性相关基因。将F2中结实率为0%的10株材料的单核发育期花粉等量混合,提取其总RNA构建不育RNA池;结实率为100%的10株材料的单核发育期的花粉等量混合,提取其总RNA构建可育RNA池。在扣除杂交中不育RNA池和可育RNA池分别做Driver和Tester。扣除杂交共做三次,使扣除更充分。扣除终产物与T-Vector连接,转化大肠杆菌DH-5α,构建扣除文库。通过Reverse Northern鉴定,去除假阳性,对阳性克隆进行测序、BLAST比较、PCR鉴定及功能分析。本研究克隆了5个在可育花药中特异表达的基因,其克隆编号分别是:B4,92,314,398和A34。测序分析结果表明,B4和314所含片段为全长序列,其他3个则仅含有基因的3′端片段。对上述5个基因的BLAST查询和生物信息学分析表明,B4所含片段与植物的遍在蛋白缀合酶（UBC）基因有很高同源性,而且含有85位Cys保守氨基酸,推断该基因为小麦的UBC基因,命名为TαUBC2,已经登录GenBank,登录号为:AY952317。生物信息学分析表明,314号克隆所含片段为一未知基因,该基因可能定位于线粒体中,与能量供应有关,推测其与育性有密切的关系。该基因命名为TaRF1,已

论文目录:

缩写词及专用名词

摘要

Abstract

第一篇综述

1 杂种优势利用及研究进展

1.1 杂种优势利用

1.2 小麦杂种优势利用国内外研究概况

1.3 小麦的几种不同的杂种优势利用系统

1.4 小麦杂种优势研究进展

2.植物细胞质雄性不育机理及研究进展

2.1 细胞质雄性不育与线粒体有关

2.2 CMS与能量代谢

2.3 细胞质雄性不育与叶绿体

2.4 细胞质雄性不育的分子机理研究

3 细胞质雄性不育育性恢复机制的研究及进展

3.1 恢复基因的研究进展

3.2 小麦T型细胞质雄性不育恢复基因定位的研究进展

3.3 植物细胞质雄性不育育性恢复的分子机制研究

4 分子生物学育种的研究进展及其应用

4.1 分子标记辅助育种

4.2 分子育种的应用

4.3 基因工程在杂种优势利用中的应用

5 基因克隆的几种技术

5.1 减法杂交和差异筛选

5.2 抑制性减法杂交

5.3 扣除杂交

5.4 cDNA差式分析法(representative difference analysis，RDA)

5.5 cDNA捕捉法

5.6 mRNA差异显示反转录PCR技术

·前言

第二篇实验部分

第一章普通小麦T型细胞质雄性不育恢复基因的遗传分析

1 材料

2 方法

2.1 育性统计

2.2 近等基因系的培育

3 实验结果与分析

3.1 F_1恢复情况

3.2 F_2的育性分离情况

3.3 F_3家系分析结果

3.4 近等基因系的培育

4 讨论

4.1 育性指标和育性的划分

4.2 恢复基因的遗传分析

4.3 连续多代考察育性的意义

第二章小麦细胞质雄性不育育性恢复相关基因的克隆及分析

1.材料

1.1 扣除杂交实验植物材料

1.2 半定量RT—PCR实验植物材料

1.3 菌株和质粒

2.仪器和药品

3.实验流程

4.方法：

4.1 BSA法建池

4.2 RNA的提纯

4.3 cDNA合成

4.4 扣除杂交

4.5 扣除产物的分离和分离产物的LD-PCR

4.6 重复扣除杂交

4.7 扣除杂交终产物的纯化

4.8 扣除文库的构建

4.9 REVERSE NORTHERN杂交

4.10 阳性克隆的测序和同源性比对及PCR鉴定

4.11 半定量RT—PCR

4.12 利用反义抑制研究TaUBC2基因在雄性不育方面的功能

结果与分析

1 小麦花药RNA的提取与纯化

2 cDNA合成及纯化

2.1 LD-PCR扩增

2.2 纯化效率分析

3.扣除文库的构建

3.1 快提质粒初步鉴定白斑

4 REVERSE NORTHERN杂交

5 阳性克隆的测序和BLAST比较

5.1 B4的基因序列和BLAST比对结果

5.2 92号克隆的测序和比对结果

5.4 314号克隆的测序和BLAST结果

5.5 398号克隆的测序和BLAST比对结果

5.6 A34克隆的测序和BLAST比对结果

6 阳性克隆的PCR鉴定

7.半定量RT—PCR研究全长cDNA的表达

7.1 RNA提取结果

7.2 TaUBC2基因的表达分析

7.3 TaRF1基因的表达分析

8.反义技术研究TaUBC2基因的功能

8.1 反义表达载体的构建

8.2 TaUBC2基因的反义表达载体TaU转化可育小麦

讨论

1.CMS育性恢复的基因控制

2 UBC基因与育性的关系

3 ATPase与细胞质雄性不育

4 BSA法构建RNA池

5 花粉作为实验材料的意义

结论

参考文献

附录：化学试剂及配方

致谢

个人简历

发布时间: 2005-08-08

参考文献

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[2].小麦T型细胞质雄性不育相关蛋白的表达及育性恢复基因Rf3的分子标记的研究[D]. 王继华.东北农业大学2004
[3].重庆温光敏核雄不育小麦育性转换规律及不育机理研究[D]. 张建奎.西南大学2006
[4].小麦新型光温敏不育系337S的遗传特性及不育基因的定位研究[D]. 郭瑞星.华中农业大学2005
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[6].莫迦小麦的T型恢复基因的染色体定位及其与K型主效不育基因的连锁关系研究[D]. 董普辉.西北农林科技大学2005
[7].小麦多子房性状的遗传研究及AFLP分子标记[D]. 马守才.西北农林科技大学2005
[8].小麦K型细胞质雄性不育系育性恢复机理的研究[D]. 詹克慧.河南农业大学2006
[9].应用化学杂交剂培育杂种小麦的研究[D]. 刘宏伟.中国农业科学院2005
[10].黏型小麦雄性不育系育性相关基因的遗传分析与表达谱研究[D]. 李红霞.西北农林科技大学2008

小麦T型CMS恢复基因的遗传分析及育性相关基因的克隆与功能研究

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