Ahil基因突变导致Joubert综合征的相关疾病机理研究

论文摘要

Joubert综合征（Joubert syndrome, JBTS）是一种十分少见的常染色体隐性遗传神经系统发育迟滞疾病。研究发现,Abelson helper integration site-1（AHI1）基因突变可导致N-端Ahi1蛋白片段形成,并导致Joubert综合征。但是AHI1基因突变引起发育迟滞的机制尚不明确。本研究发现,亨廷顿-相关蛋白1（Hap1）,一种对出生后幼鼠存活率起关键作用的蛋白,可与全长Ahi1蛋白相结合,而不能与N-端Ahi1蛋白片段结合。这一Ahi1-Hap1结合在神经分化过程中受到神经生长因子（NGF）的调控。NGF诱导Hap1A的去磷酸化,并降低其与Ahi1的结合,同时Hap1A在神经突起末端的分布增多。对小鼠脑组织蛋白的分析也表明,Ahi1在胞浆而非突触部分与磷酸化的Hap1A结合,提示Ahi1主要在神经元胞体发挥生理作用。对小鼠脑组织胞浆成分进行抗Ahi1抗体免疫共沉淀后的质谱分析发现,除Hap1外,Ahi1还与CEND1/BM88蛋白结合。CEND1/BM88是一种特异表达于神经元的蛋白,参与调控神经分化和神经发生,在出生后小鼠的脑组织中高度表达。在Ahil基因敲除小鼠的下丘脑组织中,Ahil蛋白的缺失导致CEND1/BM88水平下降,小鼠发育迟滞。而在N2a细胞中过表达Ahil则能稳定CEND1/BM88。此外,对Ahil基因敲除小鼠下丘脑神经元进行原代培养发现,神经元的突起较野生型减少,长度较短。而在该原代神经元中过表达CEND1/BM88则可促进其神经元突起生长。本研究的发现提示,在早期发育过程中,CEND1/BM88参与Ahil相关的下丘脑神经元分化。上述发现对于研究Jourbert综合征中出现的发育迟滞的相关病理机制提供了新的思路。图27幅,表3个,参考文献79篇。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 目录
• 第一章 磷酸化对Ahi1与Hap1A相互作用影响的机理研究
• 前言
• 第一节 神经营养因子对Hap1A磷酸化的影响研究
• 1 仪器与材料
• 1.1 研究对象
• 1.2 主要仪器与试剂
• 1.2.1 主要试验仪器
• 1.2.2 主要试剂与耗材
• 1.2.3 主要试剂的配置
• 2 实验方法
• 2.1 PC12细胞培养
• 2.1.1 培养条件
• 2.1.2 细胞传代
• 2.1.3 细胞冻存
• 2.1.4 细胞的冻融（复苏）
• 2.2 各种神经营养因子刺激
• 2.3 蛋白样品的制备
• 2.4 样品蛋白浓度测定
• 2.5 Western Blotting步骤
• 2.6 PC12细胞的免疫荧光步骤
• 3 结果
• 3.1 不同的神经营养因子通过不同的信号通路调节Hap1A的磷酸化
• 3.2 NGF处理后Hap1A和Ahi1在细胞中的分布
• 4 分析和讨论
• 5 结论
• 第二节 Hap1A磷酸化对Ahi1与Hap1A相互作用的影响研究
• 1 仪器与材料
• 1.1 研究对象
• 1.2 主要仪器与试剂
• 1.2.1 主要试验仪器
• 1.2.2 主要试验试剂与耗材
• 1.2.3 主要试剂的配置
• 2 实验方法
• 2.1 PC12细胞培养
• 2.1.1 培养条件
• 2.1.2 细胞传代
• 2.2 NGF刺激和细胞蛋白样品的制备
• 2.3 细胞转染
• 2.4 小鼠蛋白样品的制备
• 2.5 免疫共沉淀
• 2.6 亚细胞分离
• 2.7 Western Blotting步骤
• 2.8 PC12细胞的免疫荧光步骤
• 3 结果
• 4 分析和讨论
• 5 结论
• 第二章 Ahi1基因敲除小鼠模型的构建及行为学
• 第一节 Ahi基因敲除小鼠模型的构建
• 1 仪器与材料
• 1.1 研究对象
• 1.2 主要仪器与试剂
• 1.2.1 主要试验仪器
• 1.2.2 主要试验试剂与耗材
• 1.2.3 主要溶液的配置
• 2 实验方法
• 2.1 实验技术路线
• 2.2 Ahi1基因敲除小鼠基因型鉴定
• 2.2.1 小鼠基因组DNA的提取
• 2.2.2 引物设计
• 2.2.3 PCR反应体系（表2-1,表2-2）
• 2.2.4 rCR反应条件
• 2.2.5 PCR扩增产物检测
• 2.3 小鼠蛋白样品的制备
• 2.4 Western Blotting步骤
• 3 结果
• 4 讨论
• 5 结论
• 第二节 Ahi基因敲除小鼠模型的行为学研究
• 1 仪器与材料
• 1.1 研究对象
• 1.2 主要试验仪器
• 2 实验方法
• 2.1 小鼠体重及形态学观察
• 2.2 小鼠自主活动实验（Locomotor Activity）
• 2.3 小鼠强迫游泳实验（Forced Swim Test,FST）
• 2.4 小鼠悬尾实验（Tail Suspension Test）
• 2.5 小鼠滚轮实验（Rotarod Test）
• 2.6 统计方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 5 结论
• 第三章 Ahi1通过调节其互作蛋白CEND1介导神经分化的研究
• 第一节 Ahi1互作蛋白的筛查
• 1 仪器与材料
• 1.1 研究对象
• 1.2 主要仪器与试剂
• 1.2.1 主要试验仪器
• 1.2.2 主要试验试剂与耗材
• 1.2.3 主要溶液的配置
• 2 实验方法
• 2.1 实验技术路线
• 2.2 小鼠蛋白样品的制备
• 2.3 免疫共沉淀
• 2.4 质谱分析
• 2.5 Western Blotting步骤
• 3 结果
• 4 讨论
• 5 结论
• 第二节 Ahi1 KO小鼠中CEND1表达量的检测
• 1 仪器与材料
• 1.1 研究对象
• 1.2 主要仪器与试剂
• 2 实验方法
• 2.1 小鼠蛋白提取
• 2.2 Western Blotting
• 2.3 小鼠标本取材及切片的制备
• 2.4 小鼠脑片的免疫荧光
• 3 结果
• 4 结论
• 第三节 Ahi1与CEND1相互作用及其对神经突起分化的影响
• 1 仪器与材料
• 1.1 研究对象
• 1.2 主要仪器与试剂
• 1.2.1 主要试验仪器
• 1.2.2 主要试剂与耗材
• 1.2.3 主要溶液的配置
• 2 实验方法
• 2.1 细胞培养条件
• 2.1.1 PC12细胞的培养条件
• 2.1.2 N2A细胞的培养条件
• 2.2 小鼠下丘脑原代神经元培养
• 2.3 细胞转染及NGF处理,Cend1半衰期实验
• 2.4 Western Blotting
• 2.5 细胞免疫荧光步骤
• 3 结果
• 3.1 Ahi1蛋白稳定Cend1水平
• 3.2 Cend1的表达能减轻Ahi1突变引起的神经元分化异常
• 4 讨论
• 结论
• 参考文献
• 综述
• 参考文献
• 攻读学位期间主要的研究成果
• 致谢