论文摘要
目的 克隆球形H.pylori vacA、cagA基因,并进行序列测定及表达,研究球形H.pylori的致病性,并为抗H.pylori疫苗的研制奠定实验基础。 方法 采用亚抑菌浓度的氨苄青霉素诱导幽门螺杆菌标准株NCTC11637产生球形变异,收集球形H.pylori。从球形幽门螺杆菌基因组DNA中特异扩增出vacA、cagA基因片段,扩增的目的片段经纯化回收后克隆到pMD-18T中,转化入大肠杆菌JM109。阳性重组质粒用PCR及双酶切鉴定,并进行序列测定。采用亚克隆技术,用BamH Ⅰ和Sac Ⅰ从重组质粒pMD-18T-vacA、pMD-18T-cagA上切下vacA、cagA基因,插入表达载体pET32a（+）质粒,转化大肠杆菌BL21,阳性重组子经双酶切及PCR扩增鉴定。重组质粒pET32a（+）-vacA、pET32a（+）-cagA转化大肠杆菌,IPTG诱导表达后进行SDS-PAGE电泳和凝胶扫描定量分析。 结果 从球形幽门螺杆菌基因组DNA中分别扩增出3888bp、3444bp的vacA、cagA基因,构建重组质粒pMD-18T-vacA、pMD-18T-cagA及pET32a（+）-vacA、pET32a（+）-cagA,双酶切及PCR扩增均筛选出含目的片段的阳性克隆。测序结果显示,球形H.pylori与已公布的H.pylori vacA、cagA基因序列的同源性分别达99.8%、99.7%。推测氨基酸同源性分别达99.3%、99.2%。vacA、cagA基因在大肠杆菌中经诱导表达后分别获得约156kD、148kD的蛋白,VacA蛋白含量占全菌体蛋白含量的15.5%。 结论 成功地对球形幽门螺杆菌vacA、cagA基因进行体外扩增及构建原核重组质粒pMD-18T-vacA、pMD-18T-cagA、pET32a（+）-vacA、pET32a（+）-cagA,并经酶切及序列分析所验证,证明球形幽门螺杆菌含有完整的vacA、cagA基因,并且能在大肠杆菌中获得高效表达。球形H.pylori含有vacA、cagA基因并能体外克隆和表达,可能与其潜在的致病性有关。