含cry1Ac和vip3A双价抗虫基因植物表达载体的构建及其对水稻的转化

论文摘要

水稻(Oryza sativa)是世界上最重要的粮食作物之一。虫害引起的水稻减产,给人们带来了巨大的经济损失。传统的化学农药防治方法污染环境、毒杀非靶标昆虫；新型的微生物杀虫制剂使用安全但是见效慢,价格昂贵；目前,利用转基因技术培育出抗虫水稻成为提高水稻产量最重要的手段之一。研究表明,转两个或者多个具有不同作用位点和作用机理的毒素蛋白是增强杀虫活性、延缓靶标害虫对转基因作物产生抗性最好的措施。苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt)产生的杀虫晶体蛋白(insecticidal crystal protein, ICP)Cry1Ac对棉铃虫、甜菜夜蛾、二化螟等鳞翅目昆虫有特异毒杀作用,非晶体营养期杀虫蛋白(vegetative insecticidal protein,VIP)Vip3A对鳞翅目昆虫有广泛的毒杀作用,甚至对一些产生ICP抗性的害虫也具有高效的毒杀作用。Vip3A蛋白被称为第二代杀虫蛋白,它在靶标昆虫体内的受体位点及作用机理与第一代杀虫蛋白Cry类晶体蛋白完全不同。本研究拟利用农杆菌(Agrobacterium tumefaciems)介导法将来自苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt)的crylAc和vip3A双价基因导入水稻粳稻品种台北309(Oryza sativa cv. Taipei 309),为转基因抗虫水稻研究探索奠定基础。主要研究结果如下：1.利用最新发明的“三重同源重组”技术快速构建了含双价杀虫基因的植物表达载体pCMUASV,包括玉米泛素启动子(Ubiquitin promoter)驱动的杀虫晶体蛋白基因cry1Ac、花椰菜叶病毒启动子(CaMV35 S promoter)控制的营养期杀虫蛋白基因vip3A。2.利用农杆菌介导法,以水稻粳稻品种台北309(Oryza sativa cv.Taipei309)的胚性愈伤组织为受体,经过过潮霉素筛选培养,分化培养,生根培养,获得了10株转基因植株。3.对10株转基因植株进行分子检测。PCR扩增实验初步证实10株转基因植株均为阳性植株,阳性率为100%。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 1. 绪论
• 1.1 水稻害虫概述
• 1.2 苏云金芽胞杆菌微生物杀虫剂
• 1.2.1 Bt杀虫晶体蛋白
• 1.2.2 Bt营养期杀虫蛋白
• 1.3 Red/ET同源重组技术
• 1.4 水稻转基因方法的研究进展
• 1.4.1 农杆菌介导法
• 1.4.2 基因枪法
• 1.5 转基因水稻的研究进展
• 1.5.1 转Bt基因水稻
• 1.5.2 转蛋白酶抑制剂基因水稻
• 1.5.3 转植物凝集素基因水稻
• 1.5.4 转基因抗病水稻
• 1.5.5 转基因抗逆水稻
• 1.6 研究的目的意义及技术路线
• 1.6.1 研究的目的和意义
• 1.6.2 主要研究内容及技术路线
• 2. 植物表达载体的构建
• 2.1 材料与试剂
• 2.1.1 菌株和质粒
• 2.1.2 引物和试剂
• 2.1.3 培养基和抗生素
• 2.1.4 仪器设备
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 E.coli中质粒的提取和鉴定
• 2.2.2 PCR扩增
• 2.2.3 冻融法回收DNA片段
• 2.2.4 DNA连接
• 2.2.5 大肠杆菌GB2005感受态细胞的制备
• 2.2.6 DNA热转化大肠杆菌
• 2.2.7 E.coli GBRed菌株中利用Red/ET构建质粒
• 2.2.8 重组质粒电转化入A.tumefaciens
• 2.2.9 A.tumefaciens重组子的鉴定
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 pETUG重组质粒的构建
• 2.3.2 pETUA重组质粒的构建
• 2.3.3 pCMUA重组质粒的构建
• 2.3.4 pCMUA重组质粒热转化GBRed
• 2.3.5 Red/ET重组构建最终植物表达载体pCMUASV
• 2.3.6 pCMUASV重组质粒电转化农杆菌EHA105
• 3. 农杆菌介导法转化水稻
• 3.1 材料与试剂设备
• 3.1.1 供试材料、试剂
• 3.1.2 主要仪器设备
• 3.1.3 培养基及抗生素
• 3.4 实验方法
• 3.4.1 水稻幼胚愈伤组织的诱导
• 3.4.2 预培养
• 3.4.3 农杆菌的培养
• 3.4.4 农杆菌侵染和共培养
• 3.4.5 选择培养
• 3.4.6 分化与生根培养
• 3.4.7 转基因植株的分子检测
• 3.5 结果与分析
• 3.5.1 转基因水稻植株的获得
• 0代中vip3A和crylAc的PCR检测'>3.5.2 T₀代中vip3A和crylAc的PCR检测
• 4 讨论
• 4.1 抗虫基因的选择
• 4.2 Red/ET同源重组构建含双价基因的植物表达载体
• 4.3 转化受体
• 4.4 共培养时间对于转化的影响
• 4.5 选择标记
• 5 结论与展望
• 5.1 主要结论
• 5.2 后续研究工作展望
• 参考文献
• 附录
• 致谢