论文摘要
目的合成抗癌化合物二-（4-氯苯甲酰异羟肟酸）二正丁基合锡（DBDCT）,制备注射剂和脂质体两种制剂,建立其质量标准,进行体外和体内抗肿瘤活性测定,研究大鼠尾静脉注射DBDCT后的药代动力学,并通过体外肿瘤细胞培养研究其引起肿瘤细胞毒的作用机制。方法（1）合成2种有机锡化合物,并通过红外光谱（IR）、核磁共振氢谱（1H NMR）、碳谱(13C NMR)、锡谱(119Sn NMR)、质谱（MS）以及X-射线单晶衍射（X-Ray）进行结构表征。选择体外活性较强的化合物2（DBDCT）作为研究对象,制备其注射剂和脂质体两种制剂,并建立两种剂型的质量标准;（2）通过Bliss法测定小鼠静脉注射DBDCT后的半数致死量(LD50),为体内抗肿瘤药效学和药代动力学研究给药剂量提供依据;（3）以肿瘤移植小鼠为模型,以顺铂（DDP）为阳性对照,研究静脉注射低、中、高三个剂量DBDCT后S180、H22和EAC小鼠体内的抗癌活性,同时考察实验小鼠外周血白血球数目、免疫器官胸腺和脾脏重量和指数、脏器重量和系数以及血液主要生化指标等,初步判断药物作用的毒性靶器官,采用G-CSF ELISE试验,检测DBDCT是否引起造模小鼠的炎症;（4）通过HPLC和UPLC-MS技术,研究大鼠尾静脉单剂量注射高、中、低三种剂量DBDCT注射液后原药及其主要代谢物在生物体内的吸收、分布、生物转化和排泄等过程,通过平衡透析法测定DBDCT与大鼠血浆蛋白结合率;（5）DBDCT作用后,采用MTT法测定体外培养的细胞株的增殖抑制率,并以SGC-7901为代表,采用流式细胞术（FCM）研究DBDCT对SGC-7901细胞增殖指数和细胞周期影响,通过光镜、荧光染色和电镜等方法观察细胞核形态的变化,FCM和Annexin V-FITC方法测定细胞凋亡率,DNA Lander方法检测肿瘤细胞凋亡的特异性条带,用RT-PCR法检测p53、p21、Bcl-2和Bax表达,免疫组化法检测p21和PCNA蛋白表达情况;（6）采用分光光度法测定DBDCT对SGC-7901癌细胞作用前后Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9活性的变化;用Caspase-8抑制剂阻断DBDCT诱导SGC-7901细胞的Caspase-8途径产生的凋亡;采用新型荧光染料Flou 3-AM检测Ca2+水平,以罗丹明123测定线粒体跨膜电位（△Ψm）变化,同时检测作为第二信使的活性氧（ROS）的表达,并通过Western blot分析Caspase-3、Cyt-C、Bax和Bcl-2等蛋白表达,进一步证实Caspases凋亡信号转导通路。结果（1）得到了2种新的有机锡化合物,分别为:[（n-Bu）2Sn（C7H5NO2Cl）Cl]和[（n-Bu）2Sn（C7H5NO2Cl）2]（DBDCT）。制备了DBDCT注射剂（7.5mg/5ml）和脂质体（10mg/10ml）两种剂型,并建立了质量标准,注射剂质量标准包括性状、鉴别、检查（pH值、装量、有关物质和无菌、热源）、含量测定等;脂质体包括形态、粒径、包封率、突释效应和有机溶剂检查、含量测定等,为后续动物试验质量控制提供了保障;（2）急性毒性试验表明静脉注射DBDCT后的半数致死量LD50=21.1mg/kg,LD50（Feiller校正）95%的可信限为17.4～25.5mg/kg,LD50的标准误为0.01;（3）体内抗肿瘤药效学实验中,DBDCT注射液组对S180和H22的生长显示了不同的抑制作用,中剂量和高剂量组与空白对照组相比有显著性差异（P＜0.05和P＜0.01）。各剂量组对EAC小鼠的生命延长率显示了不同的影响,三次测定低剂量组生命延长率分别为8.43%、30.97%、24.82%,中剂量组生命延长率分别为85.1%、79.2%、73.4%,高剂量组生命延长率分别为87.2%、82.6%、79.6%,中剂量组和高剂量组生命延长率远远高于阳性对照组（P＜0.001）。体内抗肿瘤活性显示出良好的剂量依赖性。采用G-CSF ELISE试验,以角叉菜胶为急性非特异性炎症模型,结果显示,实验组和阳性对照组小鼠的外周血白血球数目显著高于空白对照组,阳性对照组小鼠的G-CSF含量也显著高于空白对照组（P＜0.001）,但各实验组与空白对照组相比G-CSF含量并无显著性差异（P＞0.05）,提示DBDCT可能不会引起小鼠体内炎症感染、化脓菌或其毒素侵人,可能对骨髓造血系统有影响。试验中S180、H22和EAC小鼠的胸腺指数和脾脏指数随着DBDCT剂量的增大而降低,DBDCT可能会抑制胸腺和脾脏的发育。高剂量组DBDCT可能对肝、睾丸、胸腺、脾和卵巢有损伤;（4）大鼠尾静脉单剂量注射2、5和12mg/kg三种剂量注射液后,能迅速被分布或消除,三种剂量下分布半衰期(T1/2,α)很短,分别为2.3585、1.9614和2.1146min;消除半衰期(t1/2,β)为64.67、56.80和220.60 min。以5mg/kg的给药剂量为例对比考察了脂质体在大鼠体内的动力学参数,脂质体血药浓度可维持12h以上,药时曲线下面积AUC是相同剂量注射液的7倍以上,消除半衰期(t1/2β)为相同剂量注射液的12倍,清除率CL（s）比相同剂量注射液减小8倍左右,延长了DBDCT在体循环系统中的滞留时间。大鼠单次静脉注射5 mg/kg DBDCT 3min后DBDCT已迅速分布到各组织,且能够透过血脑屏障分布于脑组织,在肾上腺分布最高,其次是十二指肠,心脏、肝脏、睾丸和肾脏中均有较高的分布,在主要组织器官中无蓄积。尿、粪和胆汁中均检测不到原形药物,但尿和胆汁排泄过程中发现了多个代谢产物。DBDCT与大鼠血浆蛋白结合率高达59.6%～61.9%,表明DBDCT进入机体后大部分与血浆蛋白相结合,血中游离药物浓度较低。采用UPLC-MS对大鼠尾静脉给予5mg/kg注射液后血浆、尿液和胆汁中的出现的原药和代谢物进行了结构鉴定,初步推断了m/z575、m/z577、m/z579、m/z604、z607、m/z551、m/z663、m/z369和m/z565.7等九种化合物的结构。体内生物转化途径可能有加氢还原、乙基化和去乙基化反应、代谢产物与葡萄糖醛酸结合反应等。DBDCT在血浆、尿液和胆汁中均不稳定,逐渐脱掉配体、烷基和氯等基团而代谢转化,可能主要经肝微粒体酶脱烷基而代谢转化后大部分经肾或胆汁排出;（5）MTT细胞存活率试验显示,DBDCT能抑制白血病细胞HL60、宫颈癌细胞Hela、膀胱癌细胞T24以及胃腺癌细胞SGC-7901等细胞株的生长,作用效果具有一定的量效关系。DBDCT对SGC-7901作用不同时间（12h,24h,48,72h）后IC50分别为:81.6、25.3、4.5、2.8nmol·L-1。通过光镜、荧光染色和电镜观察到DBDCT处理过的SGC-7901细胞呈现凋亡细胞所特有的形态学特征,并检测到若干个凋亡小体。在琼脂糖凝胶电泳中可见凋亡特征性改变DNA梯形带。经FCM分析,从DNA组方图上可见到G0-G1期前亚二倍体凋亡峰。Annexin V-FITC实验显示不同浓度的DBDCT作用不同时间后SGC-7901细胞的凋亡率与对照组相比有统计学差异（P＜0.05）。FCM检测,DBDCT可能通过阻滞SGC-7901细胞G2-M期和S期杀伤肿瘤细胞。免疫组化法检测,随着DBDCT浓度增加,p21阳性细胞数明显增加,PCNA阳性细胞数则显著减少（P＜0.01）。RT-PCR检测caspase3、p21、p53、Bcl-2和Bax基因的表达。随着DBDCT浓度和作用时间的延长,实验组p21、p53和Bax mRNA表达明显高于空白对照组（P＜0.05和P＜0.01）,Bcl-2和Bcl-2/Bax的表达明显低于空白对照组（P＜0.001）;（6）不同浓度DBDCT对SGC-7901作用不同时间后caspase-3、caspase-8和caspase-9酶的活性显著增加（P＜0.05和P＜0.01）,证实了DBDCT诱导SGC-7901细胞凋亡与线粒体和死亡受体途径有关。采用caspase-8抑制剂不能抑制DBDCT诱导SGC-7901细胞的凋亡,确证DBDCT可通过线粒体途径诱导SGC-7901细胞凋亡。Flou 3-AM检测,细胞内Ca2+浓度显著升高。罗丹明123测定,线粒体跨膜电位显著降低或消失,与DBDCT作用剂量和时间呈负相关。DBDCT迅速引起SGC-7901细胞内ROS的增加,提示DBDCT作用于细胞后可刺激肿瘤细胞ROS的产生。通过Western blot分析Caspase-3、Cyt C、Bax和Bcl-2等蛋白表达,随着DBDCT的浓度和作用时间增加,实验组Bcl-2蛋白表达下凋,而Bax、Cyt C和Caspase3等蛋白表达上调,且有明显量效和时效关系,Bel-2/Bax蛋白比值从1.30下降至0.52,与RT-PCR的结果一致,初步证实了Caspases凋亡信号转导通路。结论（1）DBDCT注射剂和脂质体的质量标准符合要求,为后续动物试验的质量控制提供保障;（2）静脉注射DBDCT后对S180、H22和EAC小鼠具有较高的体内抗癌活性,主要的毒性靶器官可能是肝、睾丸、胸腺、脾和卵巢等,G-CSF ELISE试验检测DBDCT不会引起小鼠的炎症反应,可能具有提升白细胞的功能;（3）采用HPLC和UPLC-MS技术基本阐明了大鼠尾静脉注射DBDCT后在生物体内的吸收、分布、生物转化和排泄以及血浆蛋白结合率等,探讨了化合物发挥药效和毒性作用的化学物质基础;（4）确证了DBDCT能够诱导体外培养的SGC-7901肿瘤细胞发生凋亡,作用机制之一可能是通过p53信号传导通路:即p53激活Bax基因,抑制Bcl-2基因表达,通过破坏Bax与Bcl-2之间的平衡来完成p53介导的细胞凋亡信号转导机制;（5）DBDCT诱导SGC-7901细胞凋亡与线粒体途径、死亡受体途径有关。本文重点探讨了线粒体途径Caspases凋亡信号转导通路,即Caspase-8作为凋亡反应的上游调控蛋白,其活化将激活Caspase-9,Caspase-9又激活Caspase-3,细胞内游离Ca2+是激活Caspase-3的先决条件之一,Ca2+稳态的破坏可直接引起线粒体释放细胞色素C和一些促细胞凋亡因子。同时DBDCT诱导线粒体活性氧ROS的增加,引发Bcl-2下调和Bax上调,自由基的不断攻击引起线粒膜电位△Ψm下降,通透性增加,Cyt-C从线粒体释放后,与凋亡酶启动子结合,在脱氧三磷酸腺苷存在下激活Apaf-1。活化的Apaf-1会结合procaspase-9而启动一系列的Caspases级联反应,激活典型的线粒体凋亡通路。
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