益生菌基因组DNA免疫佐剂的研究

论文摘要

高致病性禽流感病毒（Avian Influenza Virus, AIV）H5N1亚型自1997年香港爆发后重挫全球经济，威胁公众健康。AIV H5N1的高致病性和高变异性给疫苗的研制和应用带来极大的困难。为此，研制能够提高宿主整体免疫力、抵御交叉感染和延长保护时间的禽流感疫苗佐剂显得相当有意义。益生菌基因组DNA作为新型核酸佐剂具有提高疫苗效力的潜力，因此有着巨大的研发价值。本研究选用多种益生菌，提取其基因组DNA作为AIV H5N1油乳苗的佐剂，并首次比较致病菌基因组DNA和人工合成的CpG寡聚核苷酸（CpG ODN）的免疫佐剂性。分不同剂量、不同免疫途径从体液免疫、细胞免疫、细胞因子分泌等多方面探讨其作为免疫佐剂的效果，以期找到能够较好提高AIV H5N1油乳苗效力的核酸佐剂及其递呈方式。实验结果表明：无论是益生菌基因组DNA（粪链球菌、嗜酸乳杆菌、枯草芽孢杆菌、双歧杆菌、屎链球菌），致病菌基因组DNA（革兰氏阴性菌大肠杆菌和革兰氏阳性金黄色葡萄球菌），还是合成的CpG ODN与AIV油乳苗同位点先后注射免疫时，血凝抑制（HI）效价均被严重削弱，而淋巴细胞活性、巨噬细胞吞噬活性和血清IFN-γ和IL-10浓度却略有提高。当益生菌粪链球菌FQ68基因组DNA，致病菌大肠杆菌和金黄色葡萄球菌基因组DNA及CpG ODN油裹于AIV油乳苗内后再行注射免疫时，CpG ODN和FQ68基因组能提高HI效价、血清IgG效价和血清IFN-γ浓度，而降低血清IL-10浓度，其中CpG ODN免疫佐剂性较FQ68基因组明显,而致病菌大肠杆菌和金黄色葡萄球菌基因组DNA对AIV油乳苗的免疫佐剂性较差。结论显示，基于核酸佐剂和疫苗在动物体内递呈方式的差异所导致免疫效果的不同：如果核酸佐剂在免疫时游离于疫苗抗原，其表现出的免疫佐剂性较差，而当核酸佐剂油裹于油乳苗内再行免疫，CpG ODN和益生菌基因组DNA均能提高体液和Th1型免疫应答水平，且CpG ODN免疫佐剂性好于天然细菌基因组DNA。本研究同时还得出CpG基序在动物模型鸡上也能诱导Th1型免疫应答，改变了传统疫苗诱导机体应答方式的初步结论。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 禽流感概况
• 1.1.1 禽流感简介
• 1.1.1.1 分类
• 1.1.1.2 抗原性变异
• 1.1.1.3 致病力和毒力
• 1.1.1.4 禽流感流行病学情况
• 1.1.2 禽流感公共卫生意义
• 1.1.3 禽流感防制面临的问题
• 1.2 禽流感疫苗研究进展
• 1.2.1 全病毒灭活疫苗
• 1.2.2 表达 HA 基因的重组鸡痘病毒活载体疫苗
• 1.2.3 亚单位疫苗
• 1.2.4 核酸疫苗
• 1.2.5 RNA 复制子疫苗
• 1.2.6 冷适应流感弱毒疫苗
• 1.2.7 复制缺陷型流感病毒疫苗
• 1.2.8 表位疫苗
• 1.2.9 转基因植物疫苗
• 1.3 免疫佐剂研究进展
• 1.3.1 免疫佐剂研究发展简史
• 1.3.2 免疫佐剂的类型
• 1.3.2.1 不溶性铝盐类佐剂
• 1.3.2.2 油水乳剂佐剂
• 1.3.2.3 蜂胶佐剂
• 1.3.2.4 微生物及其代谢产物佐剂
• 1.3.2.5 人工合成佐剂
• 1.3.2.6 免疫刺激复合物佐剂
• 1.3.2.7 细胞因子类佐剂
• 1.3.2.8 其它类佐剂
• 1.3.3 免疫佐剂作用方式及机理
• 1.3.3.1 免疫佐剂的作用方式
• 1.3.3.2 免疫佐剂的作用机理
• 1.4 细菌基因组及 CpG ODN 免疫性研究
• 1.4.1 CpG 寡聚核苷酸免疫激活的分子机制
• 1.4.2 CpG 寡聚核苷酸的生物学活性
• 1.4.2.1 CpG ODN 提高蛋白抗原的免疫原性
• 1.4.2.2 CpG ODN 提高 DNA 疫苗的免疫原性
• 1.4.2.3 CpG ODN 提高粘膜免疫应答
• 1.4.2.4 CpG ODN 提高新生动物的免疫力
• 1.4.2.5 CpG ODN 抗肿瘤
• 1.4.2.6 CpG ODN 刺激造血
• 1.4.3 CpG ODN 的结构特点及分类
• 1.4.4 CpG ODN 的种属特异性
• 1.4.5 CpG 与其他佐剂的比较
• 1.4.5.1 与氢氧化铝的比较
• 1.4.5.2 与弗氏完全佐剂（CFA）的比较
• 1.4.6 影响 CpG DNA 发挥作用的因素
• 1.4.6.1 寡核苷酸中 CpG 结构的序列、数量和两个 CpG 之间的碱基数
• 1.4.6.2 不同的 CpG 基序可能针对不同的免疫细胞发挥作用
• 1.4.6.3 甲基化对 CpG DNA 作用的影响
• 1.4.6.4 不同抗原对 CpG DNA 作用的影响
• 1.4.6.5 CpG DNA 的用量、使用方法以及途径对免疫刺激效果的影响
• 1.4.7 增强 CpG DNA 免疫刺激活性的因素
• 1.4.8 CpG ODN 可能的副作用
• 第二章 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 实验动物
• 2.1.2 疫苗、抗原和标准血清
• 2.1.3 细菌株
• 2.1.4 试剂盒
• 2.1.5 主要试剂与药品
• 2.1.6 主要溶液和培养基的配制
• 2.1.7 主要仪器和设备
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 母源抗体监测
• 2.2.1.1 采血分离血清
• 2.2.1.2 微量法血凝（HA）试验
• 2.2.1.3 微量法血凝抑制（HI）试验
• 2.2.1.4 结果判定
• 2.2.2 细菌基因组佐剂的制备
• 2.2.2.1 各种细菌基因组的提取
• 2.2.2.2 琼脂糖电泳鉴定
• 2.2.2.3 紫外分光光度法测定 DNA 的纯度和含量
• 2.2.2.4 SDS-PAGE
• 2.2.3 FQ68 基因组作为 AIV 油乳苗佐剂
• 2.2.4 五种菌株基因组作为 AIV 油乳苗佐剂
• 2.2.4.1 免疫程序
• 2.2.4.2 检测手段
• 2.2.4.2.1 血凝、血凝抑制
• 2.2.4.2.2 MTS 染色法检测淋巴细胞转化
• 2.2.4.2.3 碳廓清实验检测巨噬细胞活性
• 2.2.4.2.3.1 基本原理
• 2.2.4.2.3.2 操作步骤
• 2.2.4.2.4 IFN-γ浓度检测
• 2.2.5 益生菌、致病菌基因组和人工合成 CpG ODN 佐剂性的比较
• 2.2.5.1 CpG ODN
• 2.2.5.2 免疫流程
• 2.2.5.3 检测手段
• 2.2.5.3.1 抗体效价检测
• 2.2.5.3.1.1 HI 抗体效价
• 2.2.5.3.1.2 血清 IgG 抗体效价
• 2.2.5.3.2 细胞因子IL-10和IFN-γ检测
• 2.2.6 改变疫苗和佐剂递呈方式，检测佐剂免疫性
• 2.2.6.1 自制 AIV 灭活油乳苗包裹佐剂
• 2.2.6.2 免疫流程
• 2.2.6.3 检测手段
• 2.2.7 数据处理
• 第三章 结果与讨论
• 3.1 实验结果
• 3.1.1 母源抗体监测
• 3.1.2 各细菌基因组的提取
• 3.1.2.1 琼脂糖电泳验证获得基因组
• 3.1.2.2 紫外分光光度法检测
• 3.1.2.3 SDS-PAGE
• 3.1.3 FQ68 基因组作为 AIV 油乳苗佐剂
• 3.1.4 五种菌株基因组作为 AIV 油乳苗佐剂
• 3.1.4.1 血凝、血凝抑制
• 3.1.4.2 MTS 染色法检测淋巴细胞转化
• 3.1.4.3 碳廓清实验检测巨噬细胞活性
• 3.1.4.4 IFN-γ浓度检测
• 3.1.5 益生菌、致病菌基因组和人工合成 CpG ODN 佐剂性的比较
• 3.1.5.1 血凝（HI）效价
• 3.1.5.2 血清 IgG 效价
• 3.1.5.3 IFN-γ和 IL-10 浓度
• 3.1.6 改变疫苗和佐剂递呈方式，检测佐剂免疫性
• 3.1.6.1 自制 AIV 灭活油乳苗检测
• 3.1.6.2 各佐剂的佐剂性
• 3.1.6.2.1 HI 抗体效价
• 3.1.6.2.2 血清 IgG 效价
• 3.1.6.2.3 IFN-γ和 IL-10 浓度
• 3.2 讨论
• 第四章 结论
• 参考文献
• 致谢
• 附录