牛抗菌肽Bac7、Bac5和β防御素的研究 ——牛抗菌肽Bac7、Bac5和β防御素融合基因在原核、真核中的表达、纯化及抑菌活性分析

论文摘要

牛抗菌肽bac7、bac5是一种线性阳离子小分子多肽,牛β防御素（LAP）属于防御素类,他们在机体天然免疫和获得性免疫中都发挥着重要作用。本研究根据Gen Bank中公布的牛抗菌肽bac7和bac5成熟肽基因序列,人工合成了融合基因bac7-bac5成熟肽片段,将Bac7-Bac5片段克隆于原核表达载体pET32（a+）中构建了重组表达载体pET-B7-B5,将其转化于E. coli BL21（DE3）中实现了重组蛋白B7-B5（rB7-B5）的过表达,表达的rB7-B5以包涵体形式存在,rB7-B5表达量约占细菌总蛋白的36.6%,分子量大小为33kD,与预测大小相符。以8M尿素变性包涵体后,用Ni亲和层析柱纯化目的蛋白,经多步透析法复性的rB7-B5对金黄色葡萄球菌和耐药性大肠杆菌具有很好的抑菌活性,本研究为新型抗菌制剂的研制和开发奠定了基础。根据Gen Bank中公布的牛抗菌肽bac7、bac5和β防御素（LAP）成熟肽基因序列,将人工合成了的牛Bac7-Bac5-β防御素基因克隆入BAC-TO-BACTM重组杆状病毒表达系统的pFAST HTb载体中,构建成重组转座载体pFASTBac-B7-B5-Bβ,转化DH10Bac大肠杆菌感受态细胞,筛选阳性菌落,抽提大分子质粒DNA,获得含Bac7-Bac5-β防御素基因的重组杆状病毒穿梭载体,转染昆虫草地夜蛾Sf9细胞,出现细胞病变后,收集含有重组病毒颗粒的培养上清,重新感染草地夜蛾Sf9单层细胞,收集Sf9细胞超声破碎,进行12%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,可见表达的融合蛋白带,表达量约占细胞总蛋白的10.6%,分子量大小为20kD,与预测大小相符。体外抑菌实验表明,重组的rB7-B5-Bβ蛋白具有对大肠杆菌的抑菌活性,本研究为新型抗菌制剂的研制和开发奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 绪论
• 第一部分 文献综述
• 一 抗菌肽的概念和分类
• 二 抗菌肽特性及作用机制
• 2.1 抗菌肽的膜活性
• 2.2 抗菌肽的抗病毒作用及其机理
• 2.3 抗菌肽抗寄生虫的作用及其机理
• 2.4 抗菌肽对肿瘤细胞及癌实体瘤的作用及其机理
• 2.5 其他的作用机制
• 三 天蚕素，蛙皮素，蜂毒素
• 3.1 天蚕素（cecropin ）
• 3.2 蛙皮素（magainin ）
• 3.3 蜂毒素（melittin ）
• 四 抗菌肽的研究进展
• 4.1 转抗菌肽基因动植物的研究进展
• 4.2 抗菌肽的表达研究进展
• 五 存在的问题
• 六 抗菌肽的应用前景
• 第二部分 试验部分
• 试验一 牛抗菌肽Bac7-Bac5 融合基因在大肠杆菌中的过表达、纯化及活性分析
• 1 材料与方法
• 1.1 菌种、载体及宿主
• 1.2 主要试剂
• 1.3 主要溶液和培养基的配制
• 1.4 主要仪器
• 1.5 大肠埃希氏菌感受态细胞的制备及转化
• 1.6 Bac7-Bac5 抗菌肽融合基因的合成
• 1.7 Bac7-Bac5 抗菌肽融合基因原核表达载体的构建
• 1.8 最佳诱导条件的确定、融合蛋白的表达和纯化
• 1.9 重组质粒pET-B7-B5 在大肠埃希氏菌中的诱导表达
• 1.10 融合蛋白的小量纯化
• 1.11 纯化蛋白的浓度测定
• 1.12 纯化蛋白的Western blot 分析
• 1.13 融合蛋白的活性鉴定（体外抑菌试验）
• 2 结果与分析
• 2.1 重组蛋白过表达条件的优化
• 2.2 rB7-B5 的表达和纯化
• 2.3 纯化蛋白的浓度测定
• 2.4 纯化蛋白的Western blot 分析
• 2.5 融合蛋白的活性鉴定（体外抑菌试验）
• 3 讨论
• 实验二 牛抗菌肽Bac7-Bac5-β防御素串联基因在昆虫杆状病毒系统中的表达、纯化及活性分析
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 Bac7-Bac5-β防御素抗菌肽融合基因的合成
• 1.3 Bac7-Bac5-β防御素抗菌肽融合基因重组转座载体的构建
• 1.4 重组杆状病毒穿梭载体的获得
• 1.5 重组 Bacmid-B7-B5-Bβ转染Sf9 细胞
• 1.6 重组病毒的扩增和rB7-B5-Bβ蛋白的表达
• 1.7 表达产物的纯化
• 1.8 重组蛋白的活性鉴定（抑菌试验）
• 2 结果与分析
• 2.1 重组转座载体的鉴定
• 2.2 重组杆状病毒穿梭载体的鉴定
• 2.3 Bacmid-B7-B5-Bβ转染Sf9 细胞
• 2.4 B7-B5-Bβ重组蛋白在Sf9 细胞内的表达
• 2.5 表达产物的纯化
• 2.6 表达产物的活性分析（抑菌试验）
• 3 讨论
• 论文结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简历
• 石河子大学硕士研究生学位论文导师评阅表