论文摘要
目的探讨缺氧复氧对血管内皮细胞t-PA、PAI-1、NO和NOS表达的影响及辛伐他汀的干预作用,并探讨其可能的机制。方法体外培养人脐静脉内皮细胞株ECV304,使用自制的缺氧小室对ECV304进行缺氧复氧处理,将细胞培养于24孔培养板和25ml培养瓶。1.将ECV304细胞进行缺氧复氧处理,分别于缺氧2小时、复氧2、4、8、16小时收集所需标本,观察缺氧复氧对t-PA、PAI-1、NO、NOS活力及eNOSmRNA、iNOSmRNA、eNOS蛋白、表达的影响;2.不同浓度的辛伐他汀（0.1、1.0、5.0、10.0μmol/L）以及10.0μmol/L的辛伐他汀+0.2mmol/L的甲羟戊酸处理ECV304细胞24小时后再行缺氧2小时复氧2小时处理,收集所需标本,观察辛伐他汀对t-PA、PAl-1、NO和NOS活力及eNOSmRNA、iNOSmRNA、eNOS蛋白表达的影响; 3.用10.0μmol/L的辛伐他汀预处理ECV304 24小时后再行缺氧2小时、复氧2、4、8、16小时处理,收集各时间段细胞培养液,观察辛伐他汀预处理对ECV304分泌NO和NOS活力的影响。4.不同浓度的辛伐他汀（0.1、1.0、10.0μmol/L）以及10.0μmol/L的辛伐他汀+0.2 mmol/L的甲羟戊酸处理ECV304细胞24小时,收集各组细胞标本,提取总RNA和胞浆蛋白,观察辛伐他汀对eNOSmRNA、iNOSmRNA、eNOS蛋白表达的影响。测定培养液中t-PA、PAI-1浓度用ELISA法;检测培养液中NO的含量及NOS活力分别用硝酸还原酶法和化学比色法。收集25ml培养瓶细胞,进行RT-PCR检测iNOS、eNOS基因相对表达量,采用异硫青酸-苯酚-氯仿一步法提取细胞总RNA,纯度检验合格后,取总RNA做逆转录生成cDNA,进行半定量PCR,产物经图象分析系统扫描评价各组iNOS和eNOS基因相对表达量;Western-blots检测eNOS蛋白相对表达量,以上各组细胞提取总蛋白,进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,再进行电转膜,用一抗和二抗进行免疫印迹反应,显色,图象扫描分析,检测eNOS蛋白相对表达量。结果1.复氧2小时、4小时培养液中tPA浓度明显增加（P均<0.01）,缺氧2小时、复氧2、4小时:PAI-1浓度明显增加（P均<0.05）;5.0、10.0μmol/L辛
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