云南烟草病毒检测及防治研究

论文摘要

烟草病毒病是危害烟叶生产最重要的病害之一，危害烟草的病毒种类多达30多种，花叶型病毒病田间常见，曲叶型病毒病的危害呈上升趋势。为了弄清云南烟草病毒病的种类，对云南省烟草花叶型和曲叶型病毒病样品进行了血清学和分子检测，并对烟草病毒病控制进行了研究。采用抗原直接包被法和双抗体夹心法对采自云南烟草花叶病样本进行了病毒种类检测，并利用三抗体夹心法对黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus，CMV）的亚组类型进行了鉴定。在云南采集的520个病毒病样本中，烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus，TMV）、CMV和马铃薯Y病毒（Potato virus Y，PVY）总检出率分别为71.74％、55.01％和6.35％，云南、湖南和福建64个CMV阳性样品中，属亚组Ⅰ的样品为57个，占89.1％，属亚组Ⅱ样品为10个，占15.6％。采用烟草曲茎病毒（Tobacco curly shoot virus，TbCSV）、云南烟草曲叶病毒（Tobacco leaf curl Yunnan virus，TbLCYNV）、中国番茄黄化曲叶病毒（Tomato yellow leaf curl China virus，TYLCCNV）的特异引物，对云南烟草曲叶病样本的病原进行了PCR检测；采用粉虱传双生病毒PA和PB通用引物，对代表性样品进行了扩增、克隆测序和序列比对。检测表明云南烟草曲叶病是由TbCSV、TbLCYNV和TYLCCNV三种病毒引起的。109个烟草曲叶症状的样本中，TbCSV总检出率为41.3％、TbLCYNV总检出率为16.5％、TYLCCNV总检出率为53.2％。其中两种或三种病毒复合侵染的检出率为8.2％。500 bp序列比较表明，这些病毒分离物之间的相似性为77％～100％。依据500 bp序列构建的同源关系树上，所有TYLCCNV的分离物因地理隔离聚为两大类，一类为保山分离物，相互间核苷酸序列相似性为93％，另一类为文山和红河分离物，相互间核苷酸序列相似性为95％，两类之间核苷酸序列相似性为89％。对其中一个分离物Y264 DNA-A的全序列测定表明，Y264 DNA-A全长2741个核苷酸（nts）。具有典型的begomoviruses结构，共编码6个开放读码框（ORFs）。DNA-A全长与中国番茄黄化曲叶病毒分离物Y10的相似性最高，为91.3％，各ORFs编码的氨基酸序列与TYLCCNV的相似性最高。因此，Y264为TYLCCNV的一个分离物。采用三抗体夹心法对云南烟草漂浮苗样本进行了病毒种类检测，在云南采集的1400多个烟草漂浮苗样本中，TMV的检出率占总阳性样本数的95％以上；CMV和马铃薯Y属病毒（包括PVY和TEV）的检出率占总阳性样本数的5％以下。在漂浮苗移栽后至团棵期，在发病率高（20％以上）的田块中采集的480个花叶病样本中，不同田块TMV检出率48.1％～100％，而CMV和马铃薯Y属病毒（包括PVY和TEV）检出率0％～12.2％。表明危害云南烟草漂浮苗的主要病毒种类为TMV。采用半叶法测定了9种药剂对烟草病叶汁液中TMV的钝化效果，采用叶面喷雾法测定了药剂对烟草的药害浓度与药害症状。室温下一定浓度的药剂与1：10000的TMV病叶汁液等体积混合3 min时，30％有效氯漂白粉10倍液、98％磷酸三钠·12H2O 10倍液、7％有效氯次氯酸钠150倍液、美国消毒剂125倍液和75％酒精TMV的抑制率可达100％；10％二氧化氯200倍液和40％育宝150倍液与TMV混合30 min时对TMV的抑制率可达100％和96.30％；0.6％菌毒净125倍液、3.95％病毒必克800液和24％毒消800倍液与TMV混合30 min时对TMV的抑制率低于80％。除0.6％菌毒净较安全外，供试消毒剂在常用浓度下接触烟草叶片，产生较严重药害，症状因消毒剂种类不同，主要为褪绿斑点、坏死斑点和畸形。试验了在漂浮育苗池中使用消毒剂对TMV的钝化效果和烟苗出苗和生长的影响。枯斑寄主测定表明：与TMV病叶汁液2万倍稀释液接触12 hr，对TMV的抑制率高于80％的消毒剂及浓度为：30％有效氯漂白粉15 mg／L和150 mg／L；7％有效氯次氯酸钠2μl／L和20μl／L；美国消毒剂5μl／L和50μl／L。漂浮池水中加入低浓度消毒剂，出苗率和成苗率与对照差异不显著，但对烟苗后期长势的影响因消毒剂种类而有差异。对烟苗长势有促进作用的消毒剂有：磷酸三钠15mg／L～300mg／L、硫酸铜50mg／L～100mg／L、高锰酸钾10mg／L～40mg／L和24％毒消10μl／L。对烟苗长势低浓度无明显影响而高浓度有抑制作用的消毒剂有：40％育宝、30％有效氯漂白粉、7％次氯酸钠、美国消毒剂和0.6％菌毒净。为避免消毒剂对烟苗生长的影响，池水中消毒剂使用终浓度不能超过下列浓度：40％育宝100μl／L、30％有效氯漂白粉300mg／L、7％次氯酸钠20μl／L、美国消毒剂50μl／L、0.6％菌毒净100μl／L。

论文目录

• 致谢
• 目录
• 摘要
• Abstract
• 病毒缩写与中英文对照
• 第一章 文献综述
• 第一节 烟草病毒研究进展
• 1 烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus,TMV）
• 1.1 TMV株系划分
• 1.2 烟草抗TMV的抗源
• 1.3 烟草抗TMV育种
• 2 黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus,CMV）
• 2.1 CMV亚组与株系
• 2.2 烟草抗CMV的抗源
• 2.3 烟草抗CMV育种
• 3 马铃薯Y病毒（Potato virus Y,PVY）
• 3.1 株系分化
• 3.2 烟草抗PVY抗源
• 3.3 烟草抗PVY育种
• 4 烟草蚀纹病毒（Tobacco etch virus,TEV）
• 5 烟草脉斑驳病毒（Tobacco vein mottling virus,TVMV）
• 6 烟草脉带花叶病毒（Tobacco vein banding mosaic virus,TVBMV）
• 7 烟草萎蔫病毒（Tobacco wilt virus,TWV）
• 8 番茄斑萎病毒（Tomato spotted wilt virus,ToSWV）
• 9 烟草环斑病毒（Tobacco ringspot virus,TRSV）
• 10 番茄黑环病毒（Tomato black ring virus,ToBRV）
• 11 番茄环斑病毒（Tomato ringspot virus,ToRSV）
• 12 烟草坏死病毒（Tobacco necrosis virus,TNV）
• 13 苜蓿花叶病毒（Alfalfa mosaic virus,AMV）
• 14 烟草线条病毒（Tobacco streak virus,TSV）
• 15 马铃薯X病毒（Potato virus X,PVX）
• 16 绒毛烟斑驳病毒（Velvet tobacco mottle virus,VTMV）
• 17 烟草轻绿花叶病毒（Tobacco mild green mosaic virus,TMGMV）
• 18 烟草脆裂病毒（Tobacco rattle virus,TRV）
• 19 烟草脉扭病毒（Tobacco vein distorting virus,TVDV）
• 20 烟草坏死矮缩病毒（Tobacco necrotic dwarf virus,TNDV）
• 21 烟草斑驳病毒（Tobacco mottle virus,TMoV）
• 22 烟草丛顶病毒（Tobacco bushy top virus,TBTV）
• 23 烟草黄脉病毒（Tobacco yellow vein virus,TYVV）
• 24 烟草黄矮病毒（Tobacco yellow dwarf virus,TYDV）
• 25 烟草矮化病毒（Tobacco stunt virus,TStV）
• 第二节 双生病毒
• 1 双生病毒的分类与命名
• 2 双生病毒的进化
• 3 双生病毒的发生与危害
• 4 双生病毒的基因组结构
• 4.1 玉米线条病毒属（Mastrevirus）
• 4.2 甜菜曲顶病毒属（Curtovirus）
• 4.3 番茄伪曲顶病毒属（Topocuvirus）
• 4.4 菜豆金色花叶病毒属（Begomovirus）
• 5 我国烟草上的双生病毒
• 5.1 烟草曲茎病毒（Tobacco curly shoot virus,TbCSV）
• 5.2 云南烟草曲叶病毒（Tobacco leaf curl Yunnan virus,TbLCYNV）
• 5.3 中国番茄黄化曲叶病毒（Tomato yellow leaf curl China virus,TYLCCNV）
• 第三节 烟草病毒病的发生与防治
• 1 云南烟草病毒病的发生状况
• 2 烟草病毒病传染源及传播途径
• 2.1 土壤带毒
• 2.2 水源带毒
• 2.3 烟草种子带毒
• 2.4 蚜虫传毒
• 2.5 农事操作传毒
• 2.6 病残体带毒
• 2.7 生产上与传染源有关的一些发病情况
• 3 综合防治技术措施
• 3.1 抗病毒剂
• 3.2 苗期尼龙网隔离防虫
• 3.3 烟草病毒病综合防治技术措施
• 4 立题意义
• 第二章 材料与方法
• 1 材料
• 1.1 病毒
• 1.2 植物材料
• 1.3 菌株和质粒
• 1.4 试剂与仪器
• 1.5 常用缓冲液的配制
• 2 方法
• 2.1 植物总DNA提取
• 2.2 PCR技术
• 2.3 PCR产物纯化
• 2.4 DNA克隆技术
• 2.5 重组质粒的提取与鉴定
• 第三章 云南烟草花叶病主要病毒种类检测及黄瓜花叶病毒亚组鉴定
• 1 材料与方法
• 1.1 样品采集及抗血清来源
• 1.2 样品制备方法
• 1.3 病毒种类检测方法
• 1.4 CMV样品亚组鉴定
• 2 结果与分析
• 2.1 云南烟草花叶病主要病毒种类
• 2.2 云南、福建和湖南省烟草CMV亚组比例
• 3 讨论
• 第四章 云南烟草曲叶病主要病毒种类检测
• 第一节 云南烟草曲叶病的种类与分布
• 1 材料与方法
• 1.1 病毒分离物
• 1.2 植物总DNA提取
• 1.3 复合侵染检测
• 1.4 病毒基因组DNA-A克隆及序列测定
• 1.5 序列分析
• 2 结果与分析
• 2.1 云南不同地区烟草双生病毒的分布
• 2.2 DNA-A部分序列的相似性比较
• 3 讨论
• 第二节 中国番茄黄化曲叶病毒保山分离物的全基因组结构
• 1 材料与方法
• 1.1 病毒
• 1.2 植物总DNA提取
• 1.3 PCR扩增、克隆和测序
• 1.4 序列分析
• 2 结果与分析
• 2.1 病毒基因组DNA-A结构
• 2.2 Y264 DNA-A与其它双生病毒的比较及分子进化分析
• 3 讨论
• 第五章 云南烟草漂浮苗病毒病控制研究
• 第一节 漂浮苗主要病毒病种类
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 病叶样本采集与制备
• 1.3 苗根样品采集方法
• 1.4 苗根样本制备方法
• 1.5 病毒检测方法
• 2 结果与分析
• 2.1 移栽前漂浮苗病毒病种类与带毒情况
• 2.2 移栽后漂浮苗主要病毒病种类和危害情况
• 2.3 漂浮苗干病根不同制样的病毒检测效果
• 2.4 不同检测方法对漂浮苗干根中病毒的检测灵敏度
• 3 讨论
• 3.1 漂浮苗病毒种类与烟苗带毒率
• 3.2 漂浮苗旧苗盘残根TMV带毒检测
• 第二节 漂浮育苗中剪叶工具与池水消毒与病毒病控制
• 一、烟草漂浮育苗中剪叶工具消毒剂评价
• 1 材料与方法
• 1.1 钝化效果实验
• 1.2 药害实验
• 2 结果与分析
• 2.1 几种药剂对TMV的体外抑制效果
• 2.2 药害实验
• 3 讨论
• 二、消毒剂对池水中TMV的灭活效果和烟草漂浮苗出苗及生长的影响
• 1 材料与方法
• 1.1 供试消毒剂
• 1.2 供试植物
• 1.3 供试病毒
• 1.4 抑制率测定
• 1.5 池水中加入消毒剂对出苗和生长的影响
• 2 结果与分析
• 2.1 低浓度消毒剂对TMV的体外抑制效果
• 2.2 池水中消毒剂对出苗和生长的影响
• 2.3 消毒剂对池水pH的影响
• 3 讨论
• 全文小结
• 参考文献
• 附录A:常用化学试剂、分子生物学试剂及仪器
• 附录B:常用缓冲液及培养基配方