DNA损伤试剂对HeLa细胞的细胞周期检查点的影响

论文摘要

p53蛋白参与了细胞周期检查点和DNA修复等多种生命活动中,在维护基因组完整性中发挥重要的作用。多种类型的肿瘤中均发现p53的突变,提示肿瘤细胞体系中DNA损伤检查点的机制可能不同于正常的组织细胞。为探讨在p53失活的肿瘤细胞中DNA甲基化试剂引发的DNA损伤对于细胞周期的影响,我们将同步化在G1期、S期和G2/M期的HeLa细胞分别进行甲磺酸甲酯（MMS）处理。MMS的处理结果表明,各个时相的细胞周期进程均发生延迟或阻滞,其中S期细胞对药物最为敏感。进一步分子机理研究表明,三个时相中ATM-Chk2和p38 MAPK通路均被激活,但是检查点激酶1（Chk1）仅在S期中被活化,提示Chk1特异地参与了S期的DNA损伤检查点（DNA damage checkpoint）或者DNA复制检查点（DNA replication checkpoint）的作用。为了进一步确定Chk1在S期的检查点功能,我们用专一的小分子抑制剂抑制Chk1的磷酸化,发现被MMS处理的S期细胞能在未完成复制的情况下进行异常的有丝分裂;提示Chk1主要是在HeLa细胞S期的DNA损伤检查点而不是DNA复制检查点发挥其作用。我们还检查了参与G2/M期进程的cyclin B1的表达变化情况,在MMS处理的S期细胞中cyclin B1表达量不能上调,而在加入Chk1抑制剂处理后,cyclin B1则有所增加。这一结果进一步支持DNA损伤S期细胞在Chk1失活时进入异常有丝分裂的推论。我们的研究结果表明,Chk1是MMS诱发的HeLa细胞S期DNA损伤检查点的专一性的重要蛋白激酶;当MMS引发DNA损伤后,上游蛋白激酶对Chk1进行磷酸化,从而激活了S期的DNA损伤检查点,阻止细胞进入G2/M期。由于这一过程不依赖于p53的活性,因此Chk1有可能作为p53失活的肿瘤细胞的药物靶标。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第1章 绪论
• 1.1 细胞周期调控概述
• 1.1.1 周期蛋白依赖性蛋白激酶（cyclin-dependent kinases）
• 1.1.2 细胞周期检查点（cell cycle checkpoints）
• 1.2 细胞应对DNA 损伤的反应
• 1.3 DNA 损伤检查点
• 1.3.1 损伤的感受阶段
• 1.3.2 ATM-Chk2-Cdc25 损伤检查点通路
• 1.3.3 ATR-Chk1-Cdc25 损伤检查点通路
• 1.3.4 ATM/ATR-Chk2/Chk1-p53 通路
• 1.3.5 p38 MAPK-MK2 信号通路
• 1.3.6 细胞周期不同时相中的DNA 损伤检查点机制
• 1.4 DNA 复制检查点
• 1.4.1 DNA 复制检查点的激活
• 1.4.2 DNA 复制检查点的工作机制
• 1.5 P53，DNA 损伤及肿瘤
• 第2章 实验材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 本论文中所用的细胞株其来源
• 2.1.2 本论文中所用抗体来源
• 2.1.3 本论文中所用试剂来源
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 细胞培养
• 2.2.2 药物处理
• 2.2.3 细胞同步化
• 2.2.4 流式细胞术检测细胞周期
• 2.2.5 单细胞凝胶电泳（彗星电泳）
• 2.2.6 免疫印迹（western blotting）
• 2.2.7 DAPI 染色
• 2.2.8 免疫荧光染色
• 2.2.9 si RNA 转染
• 第3章 实验结果
• 3.1 HELA 细胞的同步化
• 3.2 MMS 引发HELA 细胞发生细胞周期停滞或者阻滞
• 3.3 MMS 诱导的S 期停滞是通过激活DNA 损伤检查点途径实现的
• 3.4 CHK1 在MMS 引发的S 期细胞周期检查点中的功能研究
• 3.4.1 Chk1 的失活不影响MMS 诱发的DNA 复制检查点的功能
• 3.4.2 DNA 损伤的S 期细胞在Chk1 失活时进入异常有丝分裂
• 第4章 讨论与展望
• 4.1 MMS 诱导的DNA 损伤检查点机制
• 4.2 不同时相中DNA 损伤检查点反应的比较
• 4.3 CHK1 在S 期检查点中的作用
• 4.4 展望
• 参考文献
• 附录 缩略词表
• 致谢
• 在读期间发表的学术论文与取得的研究成果