与老年性痴呆相关分泌酶基因的转录调控

论文摘要

老年性痴呆（Alzheimer’s Disease，AD）是严重危害人民健康的一类神经退行性疾病。导致AD的一个关键致病原因是大脑中淀粉样蛋白（Aβ）的过度产生和堆积。Aβ是由其前体蛋白APP经β-分泌酶（BACE1）和γ-分泌酶依次水解而生成的，因此对于这些参与Aβ产生的分泌酶的研究，包括对于它们在基因表达水平上的调控研究，具有重要意义。脑缺血和中风造成大脑相关区域缺氧会使AD的发生率大大增加，但是缺氧损伤导致AD的内在机制还不清楚。在本研究中，我们发现急性缺氧可以提高BACE1的mRNA水平和蛋白水平，并使得酶活性升高，导致APP C端片段β-CTF和Aβ的产量增加。我们通过序列分析、点突变和胶迁移分析发现，缺氧时所激活的转录因子HIF-1（hypoxia-inducible factor-1）可以结合到BACE1的启动子上。过表达HIF-1α可以增加BACE1的mRNA水平和蛋白水平，而下调HIF-1α则减少BACE1的水平。缺氧处理不能进一步增强由过表达HIF-1α引起的BACE1表达上调，说明HIF-1α在缺氧诱导的BACE1表达水平上调的过程中起主要作用。最后我们还发现在HIF-1α条件性敲除小鼠大脑海马和皮层区域BACE1蛋白水平显著减少。以上结果说明BACE1基因的表达受转录因子HIF-1的调控，并为脑缺血和中风损伤增加AD发生率的现象提供了分子机制。此外，我们还克隆了γ-分泌酶组分之一nicastrin基因的启动子区，并通过荧光素酶活性分析鉴定了该基因启动活性所必需的最小启动子区。序列分析表明，在这一启动子区域存在许多潜在的转录因子的结合位点。点突变和胶迁移实验进一步证明了潜在的转录因子结合到该启动子上。我们的研究进一步揭示了参与Aβ生成的各分泌酶基因转录调控的机制，为今后在转录水平上通过调控这些分泌酶的活性来抑制Aβ产生以达到治疗AD的目的提供了重要依据。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 前言
• 1 老年性痴呆症
• 1.1 概述
• 1.2 AD的主要病理特征
• 1.2.1 神经纤维缠结（neurofibrillary tangles,NFT）
• 1.2.2 淀粉样斑（amyloid plaques）
• 2 Aβ级联假说（Aβ cascade hypothesis）
• 2.1 Aβ的产生
• 2.2 Aβ的毒性
• 2.3 Aβ级联假说
• 3 影响APP切割的三种分泌酶
• 3.1 α-分泌酶
• 3.2 β-分泌酶
• 3.2.1 BACE1的基因结构
• 3.2.2 BACE1的蛋白结构
• 3.2.3 BACE1的转录调控
• 3.2.4 BACE1的翻译后修饰、转运和代谢
• 3.2.5 BACE1的生物学功能
• 3.3 γ-分泌酶
• 4 脑缺氧/缺血与老年性痴呆
• 5 本论文的研究内容与研究意义
• 第二章 材料与方法
• 1 材料
• 1.1 细胞株及菌种
• 1.2 质粒和载体
• 1.3 基因敲除小鼠
• 1.4 试剂
• 1.4.1 培养基
• 1.4.2 琼脂糖凝胶
• 1.4.3 RIPA裂解液
• 1.4.4 胶迁移缓冲液
• 1.4.5 免疫印迹（Western blot）所需试剂
• 1.4.6 Aβ免疫沉淀检测法所需试剂
• 1.5 其它所需试剂和材料
• 2 实验方法
• 2.1 细胞培养、缺氧处理
• 2.2 免疫印迹（Western blot）
• 2.3 瞬时转染
• 2.4 Aβ的检测
• 2.5 Pulse-chase分析
• 2.6 生物信息学分析
• 2.7 荧光素酶活性分析
• 2.8 电泳迁移率变动分析（Electrophoresis Mobility Shift Assay,EMSA）
• 2.9 体外β-分泌酶活性检测
• 2.10 总RNA的提取
• 2.11 实时荧光定量PCR（Real-time PCR,RT-PCR）
• 2.12 HIF-1α RNA干扰
• 第三章 实验结果与分析
• 1 BACE1的转录调控
• 1.1 急性缺氧上调BACE1的蛋白水平和活性并增加Aβ的分泌
• 1.2 急性缺氧通过上调BACE1的转录使其生物合成水平增加
• 1.3 BACE1启动子上HIF-1α结合位点的鉴定
• 1.4 HIF-1α调节BACE1的表达水平
• 1.5 HIF-1在缺氧诱导效应中起主要作用
• 2 nicastrin基因的转录调控
• 2.1 nicastrin基因启动子的克隆与功能性分析
• 2.1.1 nicastrin启动子的生物信息学预测分析
• 2.1.2 nicastrin基因启动子的克隆与功能性分析
• 2.2 nicastrin启动子上转录因子结合位点的鉴定
• 第四章 讨论与展望
• 参考文献
• 致谢