三维立体培养中肺癌细胞基质金属蛋白酶的表达

论文摘要

肺癌的发病率和死亡率居所有癌症的首位,其发病机制的研究也一直是热点。基质金属蛋白酶（MMPs）是一组锌离子依赖性的、在结构上具有极大同源性的内肽酶家族,能降解细胞外基质,其过度表达在肿瘤的生长、侵袭和转移中有着重要作用,因而被广泛关注和研究。本课题采用三维立体培养技术,研究肺癌细胞基质金属蛋白酶的表达情况,以探讨基质金属蛋白酶在肺癌侵袭与转移中的作用及机制。首先建立肺癌细胞的三维立体培养模型。采用人非小细胞肺癌H460细胞株传代培养,用鼠尾制取Ⅰ型胶原,并制备等离子、等渗、1×DMEM、胶原浓度为0.75mg/mL的液体胶原,按4×105个/mL接种H460细胞于胶原内,建立三维立体培养,同时建立平面培养作为对照,在24、72、120h观察细胞生长状况,用数码照相机记录,并收集细胞培养液,用明胶酶谱电泳的方法测定其中的MMP-2、MMP-9。然后将单个核细胞、肺成纤维细胞分别与H460细胞混和立体培养。单个核细胞采集自健康志愿者外周血,采用单个核细胞分离液分离制备,人胚肺成纤维细胞MRC-5细胞株传代培养,分别将两种细胞与H460细胞混和立体培养,定时观察、记录细胞生长情况,收集培养液,用明胶酶谱电泳的方法测定其中的MMP-2、MMP-9,采用Bergman法测定其中的羟脯氨酸含量,计算胶原降解量。再者在H460细胞立体培养中加入TNF-α干预因素,同样方法测定MMP-2、MMP-9和羟脯氨酸含量。最后采用明胶酶谱电泳法测定36例非小细胞肺癌患者血清和23例恶性胸水的MMP-2、MMP-9,同时测定10例健康志愿者血清和15例非恶性胸水作为对照,并用Bandscan分析软件测定电泳条带灰度值。本实验成功建立了肺癌细胞的三维立体培养模型,癌细胞及肺成纤维细胞等生长状况良好,H460细胞在立体培养条件下MMP-2、MMP-9表达比平面培养增强。H460细胞与单个核细胞混和立体培养,电泳显示MMP-2、MMP-9的表达混合组最强,其次是H460组,单个核细胞组表达不明显;胶原分解量也是混和组最高,单个核细胞组最低,组间比较差异显著（P<0.05）。H460细胞与MRC-5混和立体培养,电泳显示MMP-2、MMP-9的表达MRC-5组最强,其次为混合组,H460组表达最弱;胶原降解量同样是MRC-5组最高,H460组最低,组间比较差异显著（P<0.05）。在H460细胞的立体培养中加入TNF-α干预,电泳显示MMP-2、MMP-9表达较空白对照组增强,胶原分解量增多,有显著性差异（P<0.05）。血清标本电泳MMP-2在非小细胞肺癌患者及健康志愿者均有表达,MMP-2条带灰度测定差异不显著（P>0.05）。胸水标本电泳MMP-2、MMP-9结果显示:在恶性胸水中表达最高,漏出性胸腔积液表达最低。MMP-2条带灰度测定显示:恶性胸腔积液组测定值最高,其次为渗出性结核性胸膜炎组,漏出性胸腔积液组最低。恶性胸腔积液组、结核性胸膜炎组与漏出性胸腔积液组比较差异显著（P<0.05）,但前两者之间无明显差异（P>0.05）。研究认为三维立体培养是一种能较好模拟体内环境的研究模型,在肺癌细胞生物学特性的复制与研究方面有很大优势。我们运用这一模型发现:单个核细胞与肺癌细胞混和培养后,刺激MMP-2、MMP-9分泌增多,活性增强;肺成纤维细胞与肺癌细胞混合培养,刺激MMP-2、MMP-9表达的同时,可能更多的刺激了TIMPs的表达增强;TNF-α对肺癌细胞MMP-2、MMP-9的表达有上调的作用。血清中MMP-2的表达差异不显著,可能需要进一步增加样本深入研究后才能明确其临床意义;胸水中MMP-2、MMP-9的表达增强提示可能为恶性病变。

论文目录

• 缩略语表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 文献回顾
• 正文
• 实验一 肺癌细胞三维立体培养模型的建立
• 1 实验材料
• 1.1 细胞系
• 1.2 主要设备仪器
• 1.3 主要试剂
• 2 方法
• 2.1 活性胶原的制备
• 2.2 细胞株的培养
• 2.3 细胞立体培养
• 2.4 细胞平面培养
• 2.5 细胞形态观测
• 2.6 明胶酶谱电泳法测MMP-2、MMP-9
• 3 结果
• 3.1 细胞生长情况
• 3.2 MMP-2、MMP-9 的表达情况
• 4 讨论
• 实验二 H460 细胞与单个核细胞三维立体混合培养中MMP-2、MMP-9 的表达
• 1 实验材料
• 1.1 细胞系
• 1.2 主要设备仪器
• 1.3 主要试剂
• 2 方法
• 2.1 活性胶原的制备
• 2.2 细胞株的培养
• 2.3 单个核细胞的分离
• 2.4 细胞立体培养
• 2.5 明胶酶谱电泳法测MMP-2、MMP-9
• 2.6 羟脯氨酸含量的测定
• 2.7 统计分析
• 3 结果
• 3.1 MMP-2、MMP-9 的表达情况
• 3.2 对胶原的分解作用
• 4 讨论
• 实验三 H460 细胞与肺成纤维细胞三维立体混合培养中MMP-2、MMP-9的表达
• 1 实验材料
• 1.1 细胞系
• 1.2 主要设备仪器
• 1.3 主要试剂
• 2 方法
• 2.1 活性胶原的制备
• 2.2 细胞株的培养
• 2.3 细胞立体培养
• 2.4 细胞形态观测
• 2.5 明胶酶谱电泳法测MMP-2、MMP-9
• 2.6 羟脯氨酸含量的测定
• 2.7 统计分析
• 3 结果
• 3.1 细胞生长情况
• 3.2 MMP-2、MMP-9 的表达情况
• 3.3 对胶原的分解作用
• 4 讨论
• 实验四 TNF-Α对H460 细胞三维立体培养中MMP-2、MMP-9 的表达影响
• 1 实验材料
• 1.1 细胞系
• 1.2 主要设备仪器
• 1.3 主要试剂
• 2 方法
• 2.1 活性胶原的制备
• 2.2 细胞株的培养
• 2.3 细胞立体培养
• 2.4 明胶酶谱电泳法测MMP-2、MMP-9
• 2.5 羟脯氨酸含量的测定
• 2.6 统计分析
• 3 结果
• 3.1 MMP-2、MMP-9 的表达情况
• 3.2 胶原分解情况
• 4 讨论
• 实验五 肺癌患者外周血及恶性胸水中MMP-2、MMP-9 的表达
• 1 主要试剂及临床资料
• 1.1 主要试剂
• 1.2 临床资料
• 2 方法
• 2.1 血清标本制备
• 2.2 胸水标本制备
• 2.3 明胶的制备
• 2.4 MMP-2、MMP-9 的测定
• 2.5 蛋白定量分析
• 2.6 统计分析
• 3 结果
• 3.1 MMP-2、MMP-9 的表达情况
• 3.2 MMP-2 条带灰度测定结果
• 4 讨论
• 小结
• 参考文献
• 附录
• 个人简历和研究成果
• 致谢