玉米花期水分胁迫诱导基因PDI的克隆与功能分析

论文摘要

水分胁迫是影响玉米产量的重要因素。已有研究表明，蛋白质二硫键异构酶是存在于内质网中一种丰富的氧化还原酶，它催化蛋白形成二硫键（氧化活性）和催化错误配对二硫键的重排（异构酶活性），并具有分子伴侣活性，有可能在植物抗水分胁迫中具有关键作用。本试验借助现代生物技术，在水分胁迫下进行玉米蛋白质二硫键异构酶基因（PDI）的诱导及其特性分析研究，期望发掘抗旱关键基因的功能，为玉米抗旱育种和转基因工程提供后备基因。在中国农科院作物科学研究所玉米品种资源研究室构建的玉米花期水分胁迫抑制性差减杂交文库中，发现了PDI基因有诱导表达，利用RT-PCR技术，从玉米花丝中克隆得到了玉米蛋白质二硫键异构酶基因cDNA编码序列（GenBank登录号为EF532321）。进一步进行生物信息学技术分析表明，该序列开放阅读框为1542个碱基，编码513个氨基酸，组成的蛋白质分子式C2577H3980N648O771S11，分子量为56.7KDa，等电点PI为5.01。基因进化树分析表明玉米中的PDI基因与水稻中的PDI基因具有较近的亲缘关系。通过Northern杂交和半定量RT-PCR发现该基因在水分胁迫、盐胁迫、ABA胁迫、冷胁迫中均有诱导表达。通过亚细胞定位发现该基因在细胞核、细胞质及细胞膜中都有表达，主要集中在细胞质中表达，而该基因是否在内质网中表达，还需要做更精细的定位分析实验。通过构建PDI基因的超表达载体并将其转入野生型拟南芥中的研究发现，转基因拟南芥在盐胁迫和甘露醇胁迫下种子萌发情况明显好于野生型。综合分析本研究结果，认为PDI基因是一个关键的玉米逆境胁迫诱导基因，在转基因拟南芥中的超表达可以提高植株的抗逆性。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 引言
• 1.1 玉米抗旱性的研究
• 1.1.1 干旱对玉米伤害机制
• 1.1.2 玉米抗旱的生理生化机制
• 1.1.3 植物抗旱的分子生物学基础
• 1.2 PDI 简介
• 1.2.1 PDI 的结构
• 1.2.2 PDI 的生物学功能
• 1.2.3 植物中 PDI 的研究
• 2 玉米 PDI 基因 cDNA 的克隆及生物信息学分析
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 植物材料与处理
• 2.1.2 主要试剂
• 2.1.3 培养基配制及溶液的配制
• 2.1.4 试验所用引物
• 2.1.5 试验方法
• 2.2 试验结果
• 2.2.1 RT-PCR 扩增获得的 cDNA 片段
• 2.2.2 RT-PCR 产物的 TA 克隆与测序
• 2.2.3 PDI 核酸序列分析
• 2.2.4 PDI 氨基酸序列特性分析
• 2.2.5 PDI 基因的近化树分析
• 2.2.6 PDI 的亚细胞定位以及高级结构分析
• 2.3 讨论
• 3 玉米 PDI 基因在不同逆境胁迫下表达量的分析及亚细胞定位分析
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 植物材料与胁迫处理
• 3.1.2 主要试剂及亚细胞定位表达载体
• 3.1.3 培养基配制及溶液的配制
• 3.1.4 试验所用引物
• 3.1.5 试验方法
• 3.2 试验结果
• 3.2.1 相对含水量的测定
• 3.2.2 半定量 RT-PCR
• 3.2.3 Northern 杂交
• 3.2.4 亚细胞定位分析
• 3.3 讨论
• 4 玉米 PDI 基因转化野生型拟南芥
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 植物材料及种植方法
• 4.1.2 宿主菌及表达载体
• 4.1.3 培养基的配制
• 4.1.4 各种酶及试剂
• 4.1.5 试验方法
• 4.2 试验结果
• 4.2.1 转基因表达载体的构建
• 1 代阳性转基因植株检测'>4.2.2 T₁代阳性转基因植株检测
• 4.2.3 转基因植株和野生型植株生长情况的比较
• 4.2.4 NaCl、甘露醇胁迫对转基因和野生型拟南芥种子萌发的差异观察
• 4.3 讨论
• 5 结论
• 6 参考文献
• 在读期间发表的学术论文
• 作者简历
• 致谢