论文摘要
研究背景结肠癌是人体最常见的恶性肿瘤之一,占胃肠道肿瘤的第2位。在欧美及中国都有很高的发病率,全球结肠癌每年新发病例超过100万例。中国结肠癌发病率由上世纪70年代初的12/10万增长到目前的56/10万,升速约为每年4.2%,远超2%的国际水平。目前,针对该病的治疗主要是采用手术、化疗为主的多种治疗手段结合的综合治疗。对早期结肠癌的治疗效果相对较好,Ⅰ～Ⅱ期结肠癌患者5年生存率可以达到70～90%以上。但对于中晚期结肠癌患者而言,效果并不理想。因肿瘤侵犯、多处转移等原因导致较多患者就诊时即失去根治性手术治疗的机会而仅能进行姑息性手术、化疗等姑息性治疗。当然,手术+化疗为主的综合治疗仍是中晚期结肠癌患者较为合适的选择。但因有较多结肠癌患者长期化疗后可能出现耐药,对化疗药物敏感性较低而影响疗效,甚至部分还可因出现较严重的化疗副反应而无法进行化疗,从而影响整体治疗效果。我们知道,肿瘤耐药机制复杂,一般由以下三方面原因导致,即细胞动力学所致的耐药、生化原因所致的耐药和药理学原因所致的耐药。临床上如果两药能起协同作用,则可在不影响疗效前提下减少相互药物用量,进而有可能减少各自的毒副作用,克服由活性代谢物的低生成或高失活所引起的耐药。临床上如何克服肿瘤耐药、提高癌细胞对化疗药物的敏感性、减少临床化疗药物的用量,进而减少化疗相关副反应,顺利完成化疗过程对提高治疗效果具有重要的临床意义。此前有研究表明,从菊科植物中提取的一种倍半萜内酯化合物小白菊内酯具有较强的抗肿瘤活性,在体外可抑制多种肿瘤细胞株的生长增殖,并能诱导细胞凋亡,比如肝癌、胆管癌及多发性骨髓瘤等。另外,小白菊内酯还可以增强癌细胞对化疗药的敏感性,如增强肝癌细胞对顺铂的敏感性。但目前该药对结肠癌的作用方面的研究较少,它对结肠癌细胞的增殖与凋亡有何影响?是否可与其它化疗药物起协同作用、减少化疗药物的用量、进而在临床上增强疗效、减少化疗毒副反应?顺铂是在人体实体肿瘤治疗中使用较为广泛的抗肿瘤药,结肠癌治疗中亦有广泛应用,尤其在晚期结肠癌腹腔转移产生腹水的治疗中有较好效果。虽然顺铂抗癌谱广、作用强,但因其毒性反应大、易产生耐药性,导致顺铂在临床应用上受到一定的限制。因此寻找能够增敏顺铂的治疗药物,减轻顺铂的毒副反应具有重要的临床意义。本研究中以人的结肠癌细胞SW620作为研究对象,采用小白菊内酯及顺铂作用于SW620后,观察它们对结肠癌细胞凋亡及增殖有何影响,二者联用是否有协同、增效功能。这对临床上能否提高结肠癌细胞对化疗药物的敏感性,减少化疗药物的用量,进而减少化疗相关副反应等具有一定的指导作用。1目的结肠癌细胞SW620经过小白菊内酯及顺铂作用后,通过MTS法及流式细胞仪检测,观察小白菊内酯及顺铂对人结肠癌细胞SW620细胞增殖及凋亡方面的影响,了解小白菊内酯与顺铂二者联合使用是否可产生协同效应?是否可以增强结肠癌细胞对顺铂的敏感性?同时通过荧光定量PCR和western blot方法检测凋亡相关基因、蛋白的表达,初步探讨其可能的影响机制,为小白菊内酯用于临床治疗结肠癌,特别是与化疗药物联合应用治疗结肠癌提供理论依据。2方法2.1实验分组按细胞培养后药物处理情况,实验分组情况如下：A). MTS法检测细胞增殖实验分组为：◆溶剂对照组（DMSO组）◆小白菊内酯（PTL）各浓度组（5pmol/LL.10μol/L.15μμmol/L、20μmol/L）◆顺铂（DDP）各浓度组（2.5μmol/L.5μmol/L.7.5μmol/L、101/L）◆小白菊内酯和顺铂联合组（DDP5μmol/L+PTL10μmol/L、DDP5μmol/L+PTL20μmol/L、DDP10μmol/L+PTL10μmol/L.DDP10μmol/L+PTL20μmol/L）B).流式细胞仪（FCM）检测细胞凋亡及PCR、Western Blot检测凋亡相关基因、蛋白实验分组均为：◆溶剂对照组（DMSO组）◆小白菊内酯组（10μmol/L）◆顺铂组（5μmol/L）◆小白菊内酯+顺铂组（10μmol/L+5μmol/L）注：从A部分实验MTS检测两药联合各浓度组中选出抑制率最高的一组作为B部分实验各组用药浓度的选择依据。2.2实验方法2.2.1细胞培养及药物处理SW620细胞接种于含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中,置37℃5%CO2培养箱中培养,常规胰酶消化传代。各组细胞药物处理如下：2.2.2MTS法检测细胞增殖将对数期生长的SW620细胞消化后,计数,调整细胞浓度为1×105个/ml,分到96孔板,每孔100ul,即每孔细胞为1×104个,常规培养,待细胞贴壁后,进行药物处理。药物作用时间是24h、48h、72h。收集各个时间点的细胞（0h,24h,48h,72h）加入MTS,比例为1/10。即100ul培养液加入10ul检测液。孵育4小时后,酶标仪读板,MTS检测读取OD490数据。采用金正均法判定两药物是否具有协同作用。也称概率相加法,具体的公式：q=EAB/（EA+EB-EA×EB）,公式中EAB为联合处理组的抑制率EA、EB分别为A药和B药单独处理的抑制率,若q值在0.85-1.15间为两药合用单纯相加,若q>1.15为有协同作用,若q<0.85表示两药合用有拮抗作用。2.2.3流式细胞仪检测细胞的凋亡将SW620细胞接种于6孔板,药物处理48h后收样进行流式细胞凋亡检测。胰酶消化细胞后,用预冷的PBS清洗细胞,将细胞轻轻重悬于预冷的1×结合缓冲液中使得其密度大约为1×108细胞/ml。加入1.25μl Annexin V-FITC。室温（18-24℃）避光反应15分钟。室温800r/min离心5分钟,去除上清。将细胞用0.5ml预冷的l×结合缓冲液轻轻重悬。加入10μl Propidium Iodide。将样本放置在冰上避光保存。用流式细胞仪检测分析。2.2.4荧光定量PCR检测将SW620细胞接种于6孔板,处理24h后收集细胞样品,加入lml Trizol溶液,吹打混匀,使细胞充分裂解,静置5min；加入200μ L氯仿,沉淀蛋白；离心去上清,加入等体积的异丙醇沉淀RNA,用75%乙醇洗涤两次,加入15～60μL DEPC水溶解沉淀。取1μL RNA样品50倍稀释,在BioPhotometer plus艾本德核酸蛋白测定仪上测定OD值,OD260/OD280的比值大于1.8,说明制备的RNA较纯,无蛋白质污染。在RNase free的PCR管中进行RNA的逆转录,得到的cDNA用于PCR实验。各因子检测引物如表1所示。扩增条件是：95℃预变性5min,95℃15sec,50℃15sec,72℃32sec,30个循环,72℃后延伸5min。2.2.5Western Blot检测将SW620细胞接种于6孔板,处理48h后收集细胞样品,RIPA裂解液裂解细胞提取细胞总蛋白。BCA法测定蛋白总浓度,每孔上样量为30μg,8-12.的分离胶分离总蛋白,转膜至PVDF膜,5的脱脂奶粉室温封闭1h,PBS稀释一抗（Bax,1:500；Caspase-3,1:1500；Caspase-9,1:1000；RARP,1:1000: Bcl-2,1:1000）4℃孵育过夜,次日,TBST洗膜3次,每次5min；合适二抗室温孵育1h;TBST洗膜3次,每次5min；于暗室中进行曝光。3结果3.1MTS检测结果：将小白菊内酯和顺铂稀释成不同的浓度梯度,分别处理SW620细胞并进行MTS检测,单因素方差分析的结果显示各组间比较有统计学差异,小白菊内酯及顺铂均对SW620细胞的增殖有抑制作用。多重比较显示各试验组均与溶剂对照组有统计学差异。不同试验时间和不同试剂类型均会影响SW620细胞的增殖抑制率,对于同一试剂,不同浓度对抑制率亦有影响。对试剂类型和试验时间进行多重比较,结果显示试验类型三组间均有显著差异,小白菊内酯和顺铂（PTL+DDP）组对SW620细胞的增殖抑制率最高,其次是小白菊内酯（PTL）组,顺铂（DDP）组最低。相同浓度下小白菊内酯和顺铂对SW620细胞的增殖抑制率亦显示小白菊内酯组比顺铂组高,二者对SW620细胞的增殖抑制作用均表现出浓度依赖性。联合作用时对SW620细胞的增殖抑制作用较单药作用时增强。金正均法检测显示,小白菊内酯与顺铂联合组各组q值均介于0.85-1.15之间,说明两药联用时对SW620细胞的增殖的抑制作用可相加,亦无拮抗作用。但两药在抑制SW620细胞的增殖方面没有协同效应。3.2流式细胞仪检测显示小白菊内酯和顺铂单用组的SW620细胞凋亡率显著高于溶剂对照组,二者联用组细胞凋亡率高于单药组。溶剂对照组、小白菊内酯组、顺铂组和小白菊内酯与顺铂联用组早期凋亡的比例分别为1.25%、5.69%、3.65和8.36%,晚期凋亡的比例却变化不大,分别为5.21%、6.58%、6.03%和7.86%。3.3荧光定量PCR检测检测凋亡相关基因caspase3、caspase9、PARP、Bcl-2及Bax的mRNA水平的表达。结果提示：小白菊内酯和顺铂的单独作用可以明显下调Bcl-2的表达水平,二者联合作用时效果更明显。顺铂处理SW620细胞后,caspase3、caspase9、Bax及PARP的mRNA水平的表达量出现了上调；小白菊内酯处理后,caspase3、caspase9、Bax及PARP的mRNA水平的表达量亦出现了上调；联合作用后,四个凋亡相关基因的mRNA水平的表达较单用组上调更明显。3.4用western blot方法检测凋亡相关蛋白的表达,结果显示小白菊内酯作用后SW620细胞中的Bcl-2蛋白的表达水平明显降低,而Bax蛋白的表达水平则明显增高；小白菊内酯处理后,SW620细胞中caspase3、caspase9及PARP的蛋白水平的表达量也出现了上调。使用顺铂处理的细胞,检测蛋白的表达趋势与小白菊内酯相似。二者联合时,上述变化更加明显。4结论4.1小白菊内酯及顺铂对SW620细胞的增殖均有抑制作用,并均表现出浓度依赖性。两药联用时对SW620细胞的增殖的抑制作用可相加,无拮抗作用。但两药在抑制SW620细胞的增殖方面没有协同效应。4.2小白菊内酯及顺铂均能促进SW620细胞凋亡,二者联用时效果更明显。二者对SW620细胞凋亡的影响可能是通过下调Bcl-2及上调Bax、Caspase3、 Caspase9和PARP等凋亡相关基因的表达而发挥作用的。且可能与线粒体途径密切相关,即通过影响Bcl-2/Bax的表达平衡,从而使线粒体功能紊乱,进而激发Caspase级联反应,促使细胞凋亡。