人PRL-3基因启动子的生物信息学分析及初步研究

论文摘要

大肠癌是一种常见、严重威胁人类生命健康的恶性肿瘤。近年来，随着国民经济的发展，人民生活水平的改善，尤其是膳食结构的改变，大肠癌的发病率与死亡率有逐年上升的趋势。转移是导致大肠癌患者死亡的主要原因。临床上有一半以上的大肠癌患者在行根治性手术前已出现了微转移，它是大肠癌术后转移和复发的直接原因。因此，阐明大肠癌转移的分子机制是大肠癌研究的重要内容。PRL-3是现已发现与大肠癌转移相关的少数特异性表达分子之一。应用基因表达系列分析技术分析大肠癌肝转移基因表达谱时发现，PRL-3是在18例大肠癌肝转移标本中唯一持续高表达的基因。进一步发现，无论具体转移的部位如何，大多数大肠癌的转移标本中PRL-3的转录水平均明显增加；而该基因在正常大肠上皮或者非转移性原发大肠癌中极少表达或不表达。不同的研究组已经分别证实这一结果。因而，PRL-3成为大肠癌转移研究中的“魅力”基因，可作为大肠癌转移治疗的重要靶点。PRL-3又称为PTP4A3，位于人类第八号染色体上（8q24.3），从其基因组的结构看，其邻近区域存在如PTK2、GPR20及TSSK5P1等基因。PRL-3基因由5个外显子和4个内含子构成，其5’端和3’端均存在非翻译区域（UTR，untranslatedregions），UTR的存在可能与PRL-3基因的调控有关。PRL-3与肿瘤转移的关系已明确。到目前为止，仍存在许多待阐明的重要问题。PRL-3参与的信号通路至今尚不清楚；作为一种磷酸酶，其底物至今尚不确定；尤其重要的是调控PRL-3基因表达的机制尚不清楚。阐明PRL-3基因表达调控的机制是阐明PRL-3在肿瘤转移中作用的重要基础。研究方法：（1）运用生物信息学方法分析和预测PRL-3基因的启动子区域及其在该区域转录因子的结合位点。从美国国立生物技术中心数据库（NCBI，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/mapview）获得人PRL-3基因及其上游5kb DNA序列。应用在线数据库预测PRL-3基因的转录起始位点Transcriptional Regulatory Element Database（http://rulai.cshl.edu/cgi-bin/TRED），并获取转录起始位点上游700bp与下游300bp的DNA片段。将获得的DNA片段在NCBI上进行比对，确定相关DNA序列在基因组的位置及与PRL-3基因转录本的关系。对获得的启动子区域DNA片段潜在的转录因子结合位点进行预测。（2）将PRL-3基因启动子区域即PRL-3基因转录起始位点-699 bp至299 bp区域及含有Snail结合位点核心寡核苷酸序列CACCTG的-642 bp至-383 bp区域克隆至具有荧光素酶报告基因的pGL3-Basic载体，然后转染到人大肠癌细胞系SW480及SW620、人鼻咽癌细胞系CNE2及人胚肾上皮细胞株293A细胞，检测其启动子活性。（3）运用染色质免疫沉淀技术与PCR扩增相结合及凝胶迁移阻滞实验确定PRL-3基因的启动子区域是否存在Snail的结合位点。（4）为了进一步研究Snail与大肠癌的关系，我们以大肠癌细胞株SW480、SW620为研究对象，运用免疫细胞化学及免疫荧光细胞化学技术分析Snail在细胞内的表达情况。同时以大肠癌组织及相应癌旁粘膜、腺瘤为研究对象，运用免疫组织化学技术分析Snail在这些组织中的表达情况。主要结果：（1）应用TRED在线分析系统对人PRL-3基因的启动子区域进行预测，共获得三种可能的启动子区域；与含PRL-3基因的基因组序列进行比对，我们发现它们均位于PRL-3基因上游区域。一般认为基因的启动子区域位于该基因上游约3-5kb的区域，特别是该基因上游1kb左右的区域。由于其中第3号启动子序列距离人PRL-3基因距离最近，位于该基因上游约Ikb的DNA区域，与5’端非翻译区域邻接。为确定这一区域可能存在的转录调控元件，进一步我们应用在线Consite分析系统发现，在该区域存在多个转录因子如Snail、n-MYC、ARNT、E74A、NF-kappaB、NRF-2及AML-1等的结合位点。在该区域的-500 bp至-451 bp之间存在Snail结合的核心寡核苷酸序列CACCTG，另外在其它多个区域存在类似这一核心序列的DNA序列。（2）为证实这一区域具有调控基因转录的启动子活性，以人大肠癌细胞株SW480、SW620，中国人鼻咽癌细胞株CNE2，人胚肾上皮细胞株293A为研究对象，选取了较完整的序列（-699 bp～299 bp区域）以及其中含有Snail结合位点核心寡核苷酸序列CACCTG的短片段（-642 bp～-383 bp）克隆到相关启动子活性检测的荧光素酶报告基因载体，并进行活性检测。结果证实它们在四种不同的细胞株中均具有启动子活性（P≤0.016），其中含有Snail结合位点核心寡核苷酸序列CACCTG的短片段活性强于较完整的序列（P≤0.012）。（3）应用染色质免疫沉淀技术结合PCR扩增的方法对人大肠癌细胞株SW480细胞进行分析，发现Snail可与人大肠癌细胞株SW480细胞PRL-3基因启动子区域的多个DNA片段结合，其中包括含有Snail结合位点核心寡核苷酸序列CACCTG的短片段。运用凝胶迁移阻滞实验发现PRL-3基因启动子区域具有Snail结合位点。（4） Snail在人大肠癌细胞系SW480与SW620细胞均有较强的表达，并且定位在SW480与SW620细胞的细胞核里。Snail在正常结直肠粘膜、腺瘤、结直肠癌及淋巴结转移癌组织中的表达明显不同，差异具有显著性（x2=92.852，P=0.000）。两两比较发现，腺瘤Snail表达比正常结直肠黏膜组织强（Z=-2.902，P=0.004），淋巴结转移癌组织Snarl表达比结直肠癌组织强（Z=-4.951，P=0.000），而结直肠癌组织Snail表达比腺瘤组织强（Z=-3.572，P=0.000）。Snail表达与结直肠癌转移高度相关（Z=-2.043，P=0.041），即Snail表达弱者转移的发生率低，表达强者其转移发生率高。结论：（1） PRL-3基因的启动子位于转录起始位点上游700bp与下游300bp的邻近区域。其中-699 bp～299 bp区域及其中含有Snail结合位点核心寡核苷酸序列CACCTG的-642 bp～-383 bp区域具有较强的启动子活性。（2） PRL-3基因启动子存在转录因子Snail结合元件。Snail参与PRL—3基因的转录调节。（3）Snail与结直肠癌发生演进及转移存在联系。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 第1章 人PRL-3基因启动子的生物信息学分析
• 1.1 材料与方法
• 1.2 结果
• 1.3 讨论
• 第2章 人PRL-3基因启动子的克隆及其活性检测
• 1.1 材料与方法
• 1.2 结果
• 1.3 讨论
• 第3章 人PRL-3基因启动子Snail结合位点的初步研究
• 1.1 材料与方法
• 1.2 结果
• 1.3 讨论
• 第4章 Snail与大肠癌相关性的研究
• 1.1 材料与方法
• 1.2 结果
• 1.3 讨论
• 参考文献
• 附录
• 在读期间发表的论文
• 致谢