2D-LC-MS/MS技术分离和鉴定苏云金芽胞杆菌蛋白质组

论文摘要

建立了一套以液相系统为基础的方法来分离和鉴定一株新的苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis, Bt）库斯塔克亚种4.0718菌株蛋白质组,该系统以微量级的二维液相色谱与高分辨率质谱相偶联,采用纳升级电喷雾离子化方式对样品进行串联质谱分析。以强阳离子交换柱为第一相,反相柱为第二相,在两相之间通过十通阀连接两根并联的预柱用来脱盐和富集肽段。本研究以苏云金芽胞杆菌库斯塔克亚种4.0718新菌株营养生长中期（T1）、芽胞形成前期（T2）和芽胞后期（T3）三个时期的菌体总蛋白为材料,经过胰蛋白酶酶解和适当的酸化后通过强离子交换柱进行吸附,采用注射11个不同浓度的氯化铵溶液进行阶梯式洗脱,洗脱物经预柱脱盐和浓缩后进入反相柱进行线性梯度分离,分离后的肽段经过电喷雾离子化后直接进入质谱仪离子阱进行一级和串联二级质谱的分析。质谱仪采得的数据通过Sequest软件进行搜库鉴定。每个时期的样品进行一次重复性试验。初筛结果显示,三个时期分别鉴定到1201（1034）、728（662）、854（851）种蛋白,去除批次间和不同Bt亚种之间蛋白冗余后,最终鉴定到的蛋白数目分别为918、703、778种,三个时期共同鉴定到的蛋白质总数为307种。所鉴定蛋白质的分子量分布范围为4600Da～477400Da, pI值分布范围为4.01～11.84,显示出了该技术相对于双向凝胶电泳在蛋白质分离鉴定方面的优势。功能分类显示,在三个时期共有的蛋白中,绝大多数蛋白为参与物质代谢的功能蛋白,其次是参与是细胞过程的蛋白。同时采用iTRAQ标记的离线式2D-LC-MS/MS技术对三个时期的菌体蛋白进行定量分析,并对Bt4.0718菌株体内初级代谢过程进行了初步的探讨,发现了Bt体内一条重要的氮源代谢途径—GABA旁路。采用2D-LC-MS/MS技术鉴定到了Bt4.0718菌株在芽胞前期和芽胞后期表达的三种Cry类原毒素：Cry2Aa, Cry1Aa和Cry1Ac以及在不同时期表达的一系列胞内活性因子。另外本研究还鉴定到了一系列与芽胞和晶体形成相关的重要蛋白,比如芽胞调控蛋白、帮助蛋白、分子伴侣蛋白等。本文首次利用2D-LC-MS/MS技术研究Bt全细胞生理活性物质不同时期的表达情况,为深入研究Bt体内的初级代谢过程、各生物活性因子的功能、探讨Bt杀虫机制奠定了重要的理论基础。为苏云金芽胞杆菌蛋白质组学研究的新方法以及具有杀虫活力的苏云金芽胞杆菌蛋白数据库的建立积累了有价值的实验资料。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 引言
• 1.苏云金芽胞杆菌生物活性成分的研究
• 2.多维液相色谱一质谱联用技术及其在微生物研究中的应用
• 3.立题依据和意义
• 材料与方法
• 1.材料
• 2.方法
• 结果与分析
• 讨论
• 结论
• 下一步工作设想
• 参考文献
• 附录 硕士期间撰写、发表与课题相关的学术论文
• 本论文感谢以下基金项目的资助
• 致谢