灰树花多糖的分离纯化及其抗肿瘤作用机理的研究

论文摘要

灰树花是一种极具开发价值的珍贵食药用真菌。其主要功能性成分为多糖,具有抗肿瘤、免疫调节和抑菌等作用。目前从灰树花子实体中分离纯化得到的多糖已经初步被证实能够抑制肿瘤细胞的生长增殖。然而,关于灰树花多糖抗肿瘤作用机理方面的研究报道却很少。本实验通过超滤、葡聚糖凝胶过滤层析等方法对灰树花子实体多糖进行分离纯化,得到多糖组分GFD。琼脂糖凝胶电泳及高效液相色谱分析结果表明,GFD分子量约为30 kDa。理化性质分析实验结果表明,GFD为不含还原性羰基、酚羟基、游离或结合的蛋白质、核酸类物质的非淀粉类α-吡喃多糖,其糖链高度在1nm左右。通过细胞体外增殖抑制实验（MTT）表明GFD可以抑制人类肝癌细胞HepG2的生长,且呈明显的浓度依赖关系；通过HE染色、Hoechst 33342染色,AO/EB双染和扫描电镜观察发现,经GFD作用的HepG2细胞呈典型的凋亡形态学特征；经流式细胞仪分析,HepG2细胞被阻遏在S期,凋亡率随作用时间的延长而增加。通过荧光染色、免疫印记及流式细胞术检测可知：GFD抑制HepG2细胞内Notchl的表达,并且使Akt的磷酸化表达下降；同时使MAPK家族JNK的磷酸化表达上调；GFD分别与Notchl抑制剂（DAPT）,.INK抑制剂（SP600125）和Akt抑制剂（LY294002）共同作用于HepG2细胞,其凋亡率结果证明Notchl,JNK和Akt均参与了GFD诱导的细胞凋亡。另外,JNK磷酸化的上升抑制了NF-κB/p65入核,同时,NF-κB下游靶基因FLIP和Bcl-2的表达被下调,进而引发Caspases级联反应,最终引发HepG2细胞凋亡。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 1 前言
• 1.1 真菌多糖
• 1.1.1 多糖概述
• 1.1.2 真菌多糖
• 1.1.3 灰树花多糖
• 1.1.4 多糖的测定方法
• 1.1.5 多糖纯度鉴定及结构分析
• 1.1.6 多糖分子量测定
• 1.2 肿瘤
• 1.2.1 肿瘤概述
• 1.2.2 灰树花多糖抗肿瘤作用的优越性
• 1.3 细胞凋亡
• 1.3.1 细胞凋亡概述
• 1.3.2 细胞凋亡形态学特征
• 1.3.3 细胞凋亡与肿瘤
• 1.4 细胞凋亡信号转导通路
• 1.4.1 细胞凋亡信号转导通路概述
• 1.4.2 Notch与细胞凋亡
• 1.4.3 Akt与细胞凋亡
• 1.4.4 MAPK与细胞凋亡
• 1.4.5 NF-κB与细胞凋亡
• 1.5 本论文的研究目的及意义
• 1.6 本论文的主要研究内容
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 灰树花子实体与细胞株
• 2.1.2 主要药品
• 2.1.3 仪器与设备
• 2.1.4 主要溶液
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 灰树花子实体多糖的提取
• 2.2.2 灰树花子实体多糖的分离纯化
• 2.2.3 灰树花子实体多糖的纯度鉴定
• 2.2.4 GFD化性质分析
• 2.2.5 细胞体外培养
• 2.2.6 细胞体外增殖抑制实验（MTT）
• 2.2.7 GFD抗肿瘤形态学观察
• 2.2.8 流式细胞术分析细胞凋亡率和细胞周期阻滞
• 2.2.9 免疫荧光染色观察NF-κB/p65的入核
• 2.2.10 蛋白抽提实验
• 2.2.11 BCA试剂盒测定细胞蛋白浓度
• 2.2.12 免疫印迹实验
• 3 结果与讨论
• 3.1 灰树花子实体多糖的提取及分离纯化
• 3.1.1 Sephadex G-200凝胶过滤色谱分离灰树花抗肿瘤多糖粗品
• 3.1.2 Sephadex G-75凝胶过滤色谱纯化灰树花抗肿瘤多糖
• 3.2 GFD纯度鉴定及分子量测定
• 3.2.1 琼脂糖凝胶电泳鉴定GFD
• 3.2.3 高效液相色谱（HPLC）鉴定GFD并测定其分子量
• 3.3 GFD理化性质分析
• 3.3.1 GFD中性糖含量的测定
• 3.3.2 GFD显色实验
• 3.3.3 GFD紫外扫描定性分析
• 3.3.4 GFD红外光谱定性分析
• 3.3.5 原子力显微镜观察GFD
• 3.3.6 扫描电镜观察GFD
• 3.4 细胞体外增殖抑制实验（MTT）
• 3.5 细胞形态学观察
• 3.5.1 HE染色检测细胞凋亡
• 3.5.2 Hoechst33342检测细胞凋亡
• 3.5.3 AO/EB双染检测细胞凋亡
• 3.5.4 扫描电镜检测细胞凋亡
• 3.6 流式细胞术分析细胞凋亡率和细胞周期阻滞
• 3.7 GFD对HepG2细胞中NF-κB/p65入核的影响
• 3.8 Notch1在GFD诱导的HepG2细胞凋亡中的作用
• 3.8.1 GFD对HepG2细胞Notchl蛋白表达的影响
• 3.8.2 Notch1对GFD作用的HepG2细胞凋亡率的影响
• 3.9 MAPK和Akt通路在GFD诱导的HepG2细胞凋亡过程中的作用
• 3.9.1 GFD对HepG2细胞MAPK和Akt通路相关蛋白表达的影响
• 3.9.2 JNK和Akt对GFD作用的HepG2细胞凋亡率的影响
• 3.10 Notch1通路在GFD抑制HepG2细胞Akt表达中的作用
• 3.11 JNK在GFD阻止HepG2细胞NF-κB p65入核中的作用
• 3.12 NF-κB调控的相关基因的表达
• 3.13 Caspase家族成员在GFD诱导HepG2细胞凋亡过程中的作用
• 4 结论
• 5 展望
• 6 参考文献
• 7 攻读硕士学位期间发表论文情况
• 8 致谢