多胺蓄积诱导大鼠早期断奶急性期肠细胞凋亡及其机制与调控

论文摘要

为探索早期断奶急性期肠道损伤的内在原因,本研究依据灌服精胺后的两阶段反应与早期断奶适应性反应的相似性,以幼大鼠为试验动物进行了三个试验考察了早期断奶后肠道多胺供应量上升与早期断奶急性期肠细胞凋亡脱落的关系及其机制,并通过在早期断奶前灌服多胺将肠细胞新旧更替的肠道重建过程人为调控到哺乳期,以考察人工诱导的肠道成熟对缓解早期断奶应激的可能性。试验1多胺蓄积对17d大鼠早期断奶急性期肠细胞脱落的影响多胺的竞争性抑制剂（DFMO）以及禁食都具有抑制肠道多胺内源合成活性的作用,同时禁食还消除了外源多胺的摄入。因此本研究以DFMO、禁食以及DFMO+禁食不断加大对早期断奶后肠道多胺浓度的抑制,参考空白对照以考察早期断奶时肠道内外源多胺供应量的上升对幼大鼠肠道发育的影响。同窝17d大鼠分别实施4种处理,即早期断奶组（W组）、DFMO组（D组）、禁食组（F组）、禁食+DFMO组（M组）。W组于断奶前30min灌服0.1mL去离子水,按照常规人工断奶方法隔离母鼠,并提供常规幼鼠日粮和饮水;D组于断奶前30min灌服2%的DFMO溶液0.1mL,投喂常规幼鼠日粮,饮水为2%DFMO溶液;F组于断奶前30min灌服0.1ml去离子水,按照常规人工断奶方法隔离母鼠,仅提供饮水;M组于断奶前30min灌服2%的DFMO溶液0.1mL,按照常规人工断奶方法隔离母鼠,仅提供2%DFMO溶液作为饮水。24窝试验幼鼠分别在断奶后4h、8h、12h、16h、20h、24h采用颈椎错位的方式致死。测定幼鼠肠长、肠重、肠道蛋白质、DNA含量、二糖酶比活性、形态学指标以及肠道多胺含量。研究结果表明,17d大鼠断奶后12h,肠道出现多胺蓄积,同断奶前相比肠道腐胺浓度升高115.9%（P＜0.01）,亚精胺升高75.2%（P＜0.01）,精胺浓度升高30.5%（P＜0.01）。DFMO、禁食以及DFMO+禁食均可有效抑制早期断奶后肠道多胺浓度的上升,其中DFMO对腐胺、亚精胺和精胺的抑制率分别为83.7%,87.3%和68.1%,禁食的抑制率分别为89.4%,89.3%和48.7%,DFMO+禁食的抑制率则达到了100%。降低小肠多胺浓度具有抑制早期断奶肠细胞脱落的作用,表现为较高的小肠蛋白质含量和肠绒毛高度。早期断奶后内源多胺蓄积导致了断奶后12—16h的肠细胞脱落现象。而断奶后4h的肠细胞脱落现象可能是食物中外源多胺在肠上皮细胞中蓄积的结果。综上表明,早期断奶急性期肠道内外源多胺供应量的上升可导致肠细胞多胺蓄积,抑制肠道多胺的蓄积具有抑制早期断奶大鼠肠细胞脱落和肠绒毛萎缩的作用。试验2多胺蓄积诱导早期断奶大鼠肠细胞脱落的实质及分子机制多胺蓄积可诱导凋亡过程,那么试验一中早期断奶急性期的多胺蓄积与肠绒毛萎缩现象是否是通过凋亡过程联系在一起的。此外,细胞内多胺水平受严格的调控,而抗酶（OAZ）是目前唯一已知具有抑制细胞内多胺浓度上升的调节蛋白。灌服多胺可诱导哺乳大鼠肠细胞多胺蓄积性凋亡,但对断奶后大鼠肠道多胺的浓度和肠细胞的存活没有影响。这种差异提示肠道多胺的负调控机制可能存在着发育性改变。围绕上述问题,本研究采用同窝清洁级SD大鼠分别于不同时间点实施颈椎错位致死,17d断奶后0h致死（1700）,17d断奶后12h致死（1712）,21d断奶后0h致死（2100）,21d断奶后12h致死（2112）。测定各处理大鼠小肠发育指标,肠重、肠长、小肠粘膜蛋白、DNA含量,粘膜中乳糖酶、蔗糖酶比活性、粘膜抗酶蛋白含量,以及肠细胞超微形态观察。研究结果表明,21d大鼠肠道成熟度显著高于17d大鼠,表现为显著或极显著升高的肠长,肠重,空、回肠粘膜重以及蔗糖酶比活性等参数。17及21d大鼠早期断奶后12h均可引起肠细胞大量凋亡,表现为染色质浓缩,边集或呈新月状,核质比例增大,细胞质空泡变性,细胞膜皱缩。幼大鼠小肠粘膜OAZ1蛋白含量存在着发育性改变,2100大鼠相对于1700大鼠其空肠和回肠中的OAZ1蛋白含量分别升高185.7（P＜0.05）和46%（P＞0.05）。早期断奶对幼鼠空肠OAZ1蛋白水平存在显著影响,并随日龄的不同而呈现不同的变化趋势。其中17d大鼠断奶前后空肠OAZ1蛋白含量未见显著差异,而21d大鼠断奶后空肠OAZ1蛋白含量比断奶前显著上升121.7%（P＜0.05）。早期断奶对17d和21d大鼠断奶12h后回肠OAZ1蛋白含量均无显著影响。综上表明,细胞凋亡是早期断奶急性期肠细胞脱落和绒毛萎缩的重要形式,幼鼠小肠OAZ1蛋白含量存在发育性改变,OAZ1生成量不足是导致早期断奶多胺蓄积的重要原因。试验3断奶前灌服多胺（亚精胺或精胺）对缓解17d大鼠早期断奶应激的影响哺乳期灌服多胺具有促进肠细胞更替,诱导肠道提前成熟的作用。那么在早期断奶前通过灌服多胺提前驱动肠道新旧细胞更替的成熟过程则可能具有降低早期断奶肠道损伤,缓解断奶后失重的作用。同窝14d清洁级SD哺乳大鼠分别经胃管灌服5μmol亚精胺（Spd）,5μmol精胺（Spm）或生理盐水（Control）,连续灌服3天。幼鼠17d实施早期断奶,一半幼鼠断奶后立即颈椎错位致死,剩余一半独立饲养至20d后致死。考察哺乳期灌服亚精胺或精胺对大鼠断奶前后体增重、肠道发育、肠道杯状细胞类型以及肠道多胺代谢的影响。研究结果表明,14d大鼠连续3天灌服亚精胺或精胺具有促进肠道成熟的作用,表现为灌服组肠道重量、肠长、肠道蛋白质、肠道DNA含量和蔗糖酶活性上升,但同时也降低了大鼠在该阶段的的增重率。相对于对照组早期断奶后的明显失重,Spd和Spm可有效阻止17d早期断奶大鼠的断奶失重,并表现为微弱的增重,其增重率分别为3.7%（P＞0.05）和0.7%（P＞0.05）。但综合哺乳期和断奶期的体重改变,Spd和Spm并不能有效提高20d大鼠的体重,其中SPM组的体重仍显著低于对照组9.4%（P＜0.01）。Spd和Spm改变了断奶前后肠粘膜中、酸性杯状细胞的比例,灌服组在断奶后具有更高比例的酸性杯状细胞。Spd和Spm处理降低或消失了17d幼鼠肠道对早期断奶的反应性,表现为肠道重量、肠长、肠道蛋白质、肠道DNA和蔗糖酶比活性在断奶前后不受影响。给14d大鼠连续灌服3天5μmol/d亚精胺或精胺具有持续降低肠道多胺浓度的作用,其中SPM组的腐胺浓度在断奶前后分别比对照组低69.1%（P＜0.01）和73.8%（P＜0.01）。综上表明,哺乳期灌服亚精胺或精胺具有促进肠道成熟的作用,这种人工诱导的成熟具有降低早期断奶应激,缓解断奶失重,增强早期断奶后粘液屏障的作用。

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引言

第一部分文献综述

1 新生动物肠道发育规律

1.1 肠道组织结构及发育规律概述

1.2 自然断奶与消化道成熟

1.2.1 断奶期肠道组织形态学改变

1.2.2 断奶期小肠的酶学改变

1.3 早期断奶与消化道发育

1.3.1 早期断奶与肠道急性期反应

1.3.2 早期断奶与肠道适应期改变

1.4 幼龄动物消化道成熟的内在机制

1.4.1 肾上腺皮质激素与消化道成熟

1.4.2 其它激素或生长因子

2 多胺与消化道发育

2.1 肠道多胺的供给

2.1.1 哺乳期肠道多胺的供给

2.1.2 断奶期肠道多胺的供给

2.2 多胺与消化道成熟

2.2.1 多胺诱导哺乳期消化道提前成熟

2.2.2 外源多胺对肠道的作用特点

2.3 灌服多胺与肠细胞凋亡

2.4 多胺的反向调控机制

2.4.1 OAZ1及ODC的降解

2.4.2 OAZ1在动物发育过程中的表达

第二部分目前存在的问题及本研究的目的和意义

1 目前存在的问题

2 研究目的及意义

第三部分试验研究

试验一多胺蓄积对17d大鼠早期断奶急性期肠细胞脱落的影响

1 前言

2 材料与方法

2.1 试验动物

2.2 试验设计

2.3 测定指标

2.3.1 肠道样品的预处理

2.3.2 小肠形态学指标测定

2.3.3 小肠蛋白质含量的测定

2.3.4 小肠DNA含量的测定

2.3.5 小肠中乳糖酶（EC 3.2.1.23）/蔗糖酶（EC 3.2.1.48）比活性的测定

2.3.6 小肠多胺的测定

2.4 统计分析

3 结果与分析

3.1 断奶、DFMO及禁食对幼鼠体重的影响

3.2 断奶、DFMO及禁食对幼鼠小肠重量、肠长的影响

3.3 断奶、DFMO及禁食的交互作用对幼鼠小肠蛋白含量的影响

3.3.1 断奶对幼鼠小肠蛋白质含量的影响

3.3.2 DFMO对断奶幼鼠小肠蛋白质含量的影响

3.3.3 禁食对断奶幼鼠小肠蛋白质含量的影响

3.3.4 DFMO+禁食对断奶幼鼠小肠蛋白质含量的影响

3.4 断奶、DFMO及禁食对幼鼠小肠肠道DNA含量的影响

3.4.1 断奶对幼鼠小肠DNA含量的影响

3.4.2 DFMO对断奶幼鼠小肠DNA含量的影响

3.4.3 禁食对断奶幼鼠小肠DNA含量的影响

3.4.4 DFMO+禁食对断奶幼鼠小肠DNA含量的影响

3.5 断奶、DFMO及禁食对幼鼠小肠二糖酶活性的影响

3.5.1 断奶对幼鼠小肠二糖酶活性的影响

3.5.2 DFMO对断奶幼鼠小肠二糖酶活性的影响

3.5.3 禁食对断奶幼鼠小肠二糖酶活性的影响

3.5.4 DFMO+禁食对断奶幼鼠小肠二糖酶活的影响

3.6 断奶、DFMO及禁食对幼鼠小肠形态的影响

3.6.1 断奶对幼鼠小肠形态的影响

3.6.2 DFMO对断奶幼鼠小肠形态的影响

3.6.3 禁食对断奶幼鼠小肠形态的影响

3.6.4 DFMO+禁食对断奶幼鼠小肠形态的影响

3.7 断奶、DFMO及禁食对断奶后12h幼鼠小肠多胺含量的影响

3.7.1 断奶对幼鼠小肠多胺含量的影响

3.7.2 DFMO对断奶幼鼠小肠多胺含量的影响

3.7.3 禁食对断奶幼鼠小肠多胺含量的影响

3.7.4 DFMO+禁食对断奶幼鼠小肠多胺含量的影响

4 讨论

4.1 早期断奶对幼鼠小肠发育的影响

4.2 早期断奶急性期多胺蓄积对小肠发育的影响

4.2.1 DFMO对早期断奶后小肠发育的影响

4.2.2 禁食对早期断奶后小肠发育的影响

4.2.3 DFMO+禁食对早期断奶后小肠发育的影响

4.3 多胺对早期断奶幼鼠小肠成熟发育的影响

5 小结

试验二多胺蓄积诱导早期断奶大鼠肠细胞脱落的实质及分子机制

1 前言

2 材料与方法

2.1 试验动物

2.2 试验设计

2.3 测定指标

2.3.1 肠道样品的预处理

2.3.2 小肠粘膜蛋白质含量的测定

2.3.3 小肠粘膜DNA含量的测定

2.3.4 小肠粘膜中乳糖酶（EC 3.2.1.23）/蔗糖酶（EC 3.2.1.48）比活性的测定

2.3.5 小肠超微形态透射电镜观察

2.3.6 小肠粘膜OAZ1蛋白浓度的测定

2.4 统计分析

3 结果与分析

3.1 日龄及断奶12h对幼鼠发育的影响

3.1.1 断奶对幼鼠发育的影响

3.1.2 日龄对幼鼠发育的影响

3.2 日龄及断奶12h对幼鼠肠粘膜蛋白含量的影响

3.2.1 断奶对大鼠肠粘膜蛋白含量的影响

3.2.2 日龄对大鼠肠粘膜蛋白含量的影响

3.3 日龄及断奶12h对幼鼠肠粘膜二糖酶酶活的影响

3.3.1 断奶对小肠粘膜二糖酶活的影响

3.3.2 日龄对小肠粘膜二糖酶活的影响

3.4 17d和21d幼鼠断奶12h后肠细胞超微结构观察

3.5 日龄及断奶12h对幼鼠肠粘膜OAZ1蛋白含量的影响

3.5.1 日龄对肠粘膜OAZ1蛋白含量的影响

3.5.2 日龄×断奶对幼鼠肠粘膜OAZ1蛋白含量的影响

3.5.3 肠道不同区段对肠粘膜OAZ1蛋白含量的影响

4 讨论

4.1 早期断奶日龄对幼大鼠发育的影响

4.2 断奶12h对幼大鼠肠道超微形态结构的影响

4.3 幼大鼠肠粘膜OAZ1的发育性改变

4.3.1 日龄对肠粘膜OAZ1蛋白含量的影响

4.3.2 日龄×断奶对幼大鼠肠道OAZ1蛋白含量的影响

4.3.3 幼大鼠肠道不同区段对肠粘膜OAZ1蛋白含量的影响

5 小结

试验三断奶前灌服多胺（亚精胺和精胺）对缓解17d大鼠早期断奶应激的影响

1 前言

2 材料与方法

2.1 试验动物

2.2 试验设计

2.3 测定指标

2.3.1 肠道样品的预处理

2.3.2 小肠粘膜蛋白质含量的测定

2.3.3 小肠粘膜DNA含量的测定

2.3.4 小肠粘膜中乳糖酶（EC 3.2.1.23）/蔗糖酶（EC 3.2.1.48）比活性的测定

2.3.5 小肠形态学的测定

2.3.6 小肠多胺的测定

2.3.7 小肠粘液细胞的测定

2.4 统计分析

3 结果与分析

3.1 断奶前灌服亚精胺或精胺对幼大鼠断奶前后体重的影响

3.2 断奶前灌服亚精胺或精胺对幼大鼠断奶前后肠长和肠重的影响

3.3 断奶前灌服亚精胺或精胺对幼大鼠断奶前后小肠蛋白含量的影响

3.4 断奶前灌服亚精胺或精胺对幼大鼠断奶前后小肠DNA含量的影响

3.5 断奶前灌服亚精胺或精胺对幼大鼠断奶前后小肠形态的影响

3.6 断奶前灌服亚精胺或精胺对幼大鼠断奶前后小肠二糖酶比活性的影响

3.7 断奶前灌服亚精胺或精胺对幼大鼠断奶前后小肠粘液细胞类型的影响

3.8 断奶前灌服亚精胺或精胺对幼大鼠断奶前后小肠多胺浓度的影响

4 讨论

4.1 断奶前灌服亚精胺或精胺对17d幼大鼠发育的影响

4.1.1 断奶前灌服亚精胺或精胺对17d幼大鼠体增重的影响

4.1.2 断奶前灌服亚精胺或精胺对17d幼大鼠肠道发育的影响

4.2 断奶前灌服亚精胺或精胺对20d幼大鼠发育的影响

4.2.1 断奶前灌服亚精胺或精胺对20d幼大鼠体重的影响

4.2.2 断奶前灌服亚精胺或精胺对20d幼大鼠肠道发育的影响

4.3 早期断奶、亚精胺或精胺对幼大鼠肠道杯状细胞类型的影响

4.4 断奶前灌服精胺或亚精胺对断奶前后肠道多胺含量的影响

5 小结

第四部分本研究的总体讨论和结论

1 总体讨论

1.1 多胺蓄积与早期断奶急性期的肠绒毛萎缩

1.2 肠上皮细胞类型与多胺蓄积

1.2.1 OAZ1与多胺蓄积

1.2.2 多胺蓄积与肠上皮细胞类型

1.3 多胺在早期断奶过程中的两面性

1.4 适宜的多胺调控模式

2 总体结论

3 本研究的创新点

4 有待进一步研究的问题

参考文献

致谢

攻读博士学位期间发表的学术论文

多胺蓄积诱导大鼠早期断奶急性期肠细胞凋亡及其机制与调控

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