论文摘要
水稻作为世界上最重要的粮食作物之一，其产量在未来全球粮食问题中起着举足轻重的作用。光合作用作为水稻产量形成的关键因素之一，其效率的高低在很大程度上又取决于叶色，因此叶色突变体成为研究水稻光能利用率的理想材料。本研究利用Asominori在组织培养中发现的低温白叶白穗突变体wlpl为材料，开展性状鉴定、遗传分析、基因克隆及功能分析等研究，研究结果如下：1. wlp1突变体属于低温敏感的叶绿素缺陷突变体，在限制性温度23℃条件下，突变体叶片在2，3叶期出现白化现象，四叶期后开始转绿，此后与野生型差异不显著，但在抽穗期，幼穗表现出明显的白化表型。叶绿素含量测定表明，突变体在三叶期和始穗期时的叶绿素a、叶绿素b和叶绿素总量低于野生型植株。叶绿体超微结构分析表明，wlpl突变体与野生型相比，叶绿体数目变少，体积变小，没有分化出明显的片层结构，嗜锇小体明显增多。但在30℃条件下，突变体与野生型表型没有明显差异，叶绿素含量差别不大，叶绿体发育基本正常。在田间种植条件下，农艺性状考察发现，除突变体植株增高，生育期延长，其它性状及产量变化不大。2.遗传分析表明，wlp1突变表型是受一对单隐性核基因控制。本研究首先利用wlp1突变体与Nanjing11杂交衍生的F2群体中的307个突变表型单株，将该基因初步定位于第1染色体长臂的2cM的区间内。然后，利用水稻基因组数据自行开发的SSR、Indel分子标记和F2群体中1100个突变体单株，最终将突变基因精细定位在BAC克隆P0481E12大约17.5kb范围内。利用基因分析与预测网站，发现该区间有3个开放阅读框，分别为50S核糖体蛋白L13基因，热激因子基因和海藻糖合成酶基因。分别扩增测序野生型和wlp1突变体的这些基因，发现野生型与突变体在50S核糖体蛋白L13基因的编码区存在单碱基的差异（C to T），造成苏氨酸（T）变为异亮氨酸（I）。因此，我们把编码50S核糖体蛋白L13的基因确定为WLP1的候选基因。随后的转基因互补实验和RNAi干扰实验验证了该结果。3.通过搜索水稻基因组数据库发现，WLP1基因组全长2348bp，cDNA全长1033bp，包括4个外显子和3个内含子，编码228个氨基酸（分子量约为26kDa）。经过蛋白质结构域网站分析发现，该基因C端与大肠杆菌50S核糖体L13蛋白具有类似结构，包含一个序列保守的功能结构域Ribosome Protein L13，N端具有叶绿体转移肽。进化树分析表明，WLP1与来自同为禾本科植物的玉米、高粱的同源蛋白比其它生物有更近的亲缘关系。4.应用实时定量RT-PCR方法，分析了田间始穗期突变体wlp1和野生型WLP1基因在不同组织中的表达水平，结果表明在叶片中的表达量最高，叶鞘、幼穗和茎中次之，在根中的表达量最低，与GUS染色的结果一致。亚细胞定位研究表明，WLP1定位在叶绿体中，根据以上结果推测WLP1参与叶绿体的发育过程。分析WLP1基因在不同温度条件下不同发育时期的叶片中的表达发现，WLP1主要在叶片发育早期表达，随着叶片的发育表达逐渐下降，低温可增加WLP1的表达。基因突变后，wlp1基因表达上调，且低温延迟该基因的表达。同时，叶绿素合成、光合作用以及叶绿体发育相关基因的表达分析表明，低温条件下，叶绿素合成相关基因HEMA1、CAO1、DVR、YGL1以及叶绿体发育相关基因V1、V2、OsPPR1表达上调，而光合作用相关基因cab1R，cab2R， psaA，psbA和RbcL表达下调。然而，在正常温度条件下，除cab2和psaA外大部分基因的表达在野生型和突变体之间变化不大。对RNA聚合酶相关基因的表达分析发现，rpoA，rpoB和RpoTp在突变体中的表达明显上调，且低温可加剧它们的表达。这些结果表明WLP1在叶片发育的早期发挥作用，功能突变后在低温条件下引起叶绿体内翻译受损，反馈调节上游基因过量表达，而下游基因由于转录/翻译系统的受损而表达下调。